SEMESTRUL I
LUCRAREA PRACTICA NR. 1
III. MICROSCOPIA OPTICĂ
Investigaţiile citologice se bazează pe preparatele „microscopice” numite extemporanee sau nepermanente şi cele permanente, care se examinează fie la microscopul optic sau fotonic, fie la alte tipuri de microscoape, cum sunt: microscoape cu fluorescenţă, microscoape cu lumină ultravioletă (UV), microscoape cu câmp întunecat, microscoape de forţă atomică şi microscoape electronice prin transmisie (TEM) sau prin baleiaj (SEM).
A. Microscopul optic uzual 1. Printre primele instrumente folosite pentru studiul celulelor a fost microscopul optic (Fig. I-1), oferind posibilitatea studierii detaliilor ce nu pot fi observate cu ochiul liber. Aceste detalii pot fi observate pe baza proprietăţilor luminii (natura ei ondulatorie), a proprietăţilor optice ale materiei (dimensiuni, indici de refracţie, coeficienţi de absorţie) şi a proprietăţilor fiziologice ale ochiului. a. Formarea imaginii este supusă legilor opticii. Microscoapele optice sau fotonice utilizează pentru obţinerea unei imagini mărite a preparatelor, efectele optice ale lentilelor asupra radiaţiilor fotonice ale spectrului luminos. b. Pe retină se formează imaginea redusă şi răsturnată a tuturor obiectelor spre care ne îndreptăm privirea. Capacitatea ochiului de a distinge detaliile obiectelor vizibile se numeşte acuitate vizuală. (1) Acuitatea vizuală este condiţionată de structura retinei şi de distanţa care separă detaliile unele de altele. Detaliile unui obiect pot fi văzute distinct numai când imaginea lor se formează pe o regiune a retinei numită pata galbenă. (a) Pentru ca două puncte, A şi B, ale unui obiect să fie percepute distinct este necesar ca imaginile lor pe retină, a şi b, să se formeze la o distanţă de 4 µm; dacă distanţa respectivă este sub 4 µm vom avea impresia existenţei unui singur punct. (b) Explicaţia constă în aceea că cele două imagini a şi b, trebuie să se formeze pe două celule cu conuri din retină separate printr-o altă celulă neimpresionată, diametrul unui con fiind de 4 µm. (2) La această distanţă de 4 µm a proiecţiei pe retină corespunde o distanţă AB de 0,1 mm (100 µm) dacă obiectul se află la distanţa vederii distincte a ochiului normal (20-25 cm). Distanţa minimă la care două puncte se pot observa distinct se numeşte distanţă separatoare minimă sau putere de rezoluţie (rezoluţie) (Fig I-2). Rezoluţia ochiului uman este prin urmare de 100 µm. c. Microscopia se bazează pe proprietatea lentilelor convergente de a da imaginea unui obiect luminos aşezat înaintea lor, la o anumită distanţă (Fig. I-3). (1) Dacă obiectul AB se află în faţa unei lentile convergente, la o distanţă mai mare decât distanţa focală (f), de cealaltă parte a lentilei se va forma imaginea reală, mărită şi răsturnată, ab, la întâlnirea razelor refractate cu axele secundare. (2) Dacă obiectul este între lentilă şi focar, imaginea obiectului se va forma înaintea lentilei (şi înapoia obiectului), imaginea fiind mărită, dreaptă şi virtuală. Se numeşte virtuală fiindcă nu poate fi proiectată pe un ecran sau pe o placă fotografică, spre deosebire de cea reală. 2. Microscopul este compus din două sisteme de lentile: un sistem numit obiectiv, în faţa căruia se aşează obiectul şi un sistem numit ocular, prin care privim imaginea proiectată de obiectiv, la fel cum am privi cu o lupă un obiect (Fig. I-4, Fig. I-5). a. Sistemele de lentile au o construcţie specială pentru a elimina aberaţiile lentilelor. b. În mod simplificat putem considera obiectivul şi ocularul echivalente fiecare unei lentile convergente. (1) Imaginea formată de obiectiv, reală, mărită si răsturnată, se formează între focarul F şi lentila ocularului. Prin urmare imaginea finală obţinută Ia microscop este mărită, virtuală şi răsturnată faţă de obiect. (2) Dacă dorim să proiectăm imaginea pe un ecran sau să o fotografiem este necesar să utilizăm un sistem optic special care să dea o imagine finală reală. c. Mărirea produsă de microscop este produsul măririi date de obiectiv şi a măririi date de ocular. În practică, mărirea maximă produsă la microscopul optic este de 1500x corespunzând unui obiectiv ce măreşte de 100x şi unui ocular ce măreşte de 15x. 3. Rezoluţia microscopului (ca şi a oricărui instrument optic sau a ochiului uman) este dată de formula lui Abbe:
d0 – distanţa separatoare minimă, λ – lungimea de undă a radiaţiei folosite pentru formarea imaginii, n – indicele de refracţie al mediului dintre obiect şi prima lentilă a obiectivului (lentila frontală), α – unghiul de deschidere (apertură) al lentilei frontale a obiectivului, adică unghiul format de razele divergente extreme, care, plecând din central obiectului pătrund în obiectiv. a. Mărimea “[pic]” este numită şi apertură numerică. Analizând formula reies posibilităţile pe care le avem spre a obţine o rezoluţie cât mai bună (d cât mai mic). b. Utilizarea unor radiaţii cu lungime de undă mai mică (raze ultraviolete în cazul microscopului de UV sau electroni în cazul microscopului electronic), n mai mare (n=1 în aer, n=1,33 în apă şi n=1,51 în ulei de cedru, folosit ca mediu optic între obiect şi obiectivul de imersie). c. Rezoluţia microscoapelor optice este de 0,3 µm fără imersie, 0,2 µm cu imersie, 0,1 µm în cazul fotografierii cu raze ultraviolete. 4. Descrierea microscopului optic. Microscopul optic este constituit din: partea mecanică, sursa de lumină şi aparatul de transmis lumina, partea optică (obiectiv şi ocular). a. Partea mecanică (stativul) (Fig. I-4) se compune din talpa sau piciorul microscopului, coloană (în continuarea piciorului), platina sau măsuţa microscopului (pe care se aşează lama), tubul (ce are la extremităţile sale obiectivul şi ocularul), dispozitivul de punere la punct (viza macrometrică, pentru deplasări mari ale tubului şi viză micrometrică, pentru deplasări fine), revolverul (dispozitivul pe care se adaptează obiectivele). b. Sursa de lumină este de obicei o lampă cu filament alimentată de la reţea printr-un transformator. Lumina este concentrată pe obiectivul examinat printr-un sistem de lentile numit condensor, prevăzut cu o diafragmă. c. Partea optică este reprezentată de obiectiv şi ocular (Fig. I-5). (1) Obiectivele pot fi uscate (care măresc imaginea de 6x, 10x, 20x şi 40x) şi cu imersie (mărire 90x). Ocularele măresc de 5x, 7x şi 10x. Prin urmare la microscopul pentru care s-au dat cifrele de mai sus mărirea maximă este de 90 x 10 = 900. (2) Ocularele se montează într-o lupă binoculară. Pentru fotografierea imaginii văzute la microscop se demontează lupa binoculară şi în locul ei se instalează o lentilă de proiecţie şi un aparat de fotografiat. 5. Tehnica punerii la punct a imaginii la microscop a. La extremitatea superioară a tubului se află un ocular de mărire mică sau mijlocie. Prin rotirea revolverului se aduce în axa microscopului un obiectiv slab (10x). b. Se coboară condensorul pentru a obţine o iluminare uniformă de o intensitate potrivită. c. Se aşează pe platină lama cu preparatul de studiat cu lamela în sus şi se fixează lama cu ajutorul valeţilor. d. Se aduce în axa optică obiectul cu ajutorul şuruburilor ce deplasează platina. (1) Privind din lateral se ridică platina, cu ajutorul vizei macrometrice până la o distanţă mai mică decât distanţa focală a obiectivului (înscrisă pe obiectiv: 16 mm la obiectivul 10x, 8 mm la obiectivul 20x şi 4 mm la obiectivul 40x). (2) Privind apoi prin ocular se coboară încet platina prin manevrarea şurubului macrometric, până când apare imaginea în câmpul microscopului. Dacă nu se vede nimic, se datorează fie faptului că obiectul nu se află în axa optică, fie am coborât prea repede platina şi deci operaţia se reia de la început. e. Nu se va căuta niciodată imaginea prin ridicarea platinei fiindcă există riscul de a deteriora lama şi obiectivul, mai ales când întrebuinţăm obiective puternice. Completarea punerii la punct se face cu viza micrometrică. (1) În timpul observării, viza micrometrică va fi manevrată continuu în ambele sensuri, pentru a parcurge toate planurile preparatului şi a cruţa acomodarea ochiului observatorului. (2) Un bun observator ţine în pemanenţă o mână pe viza micrometrică, iar cu mâna cealaltă desenează imaginea. f. După ce s-a pus la punct imaginea cu obiectivul 10x, pentru examinarea cu obiectivul 20x (sau 40x) se roteşte revolverul aducând în axa optică acest obiectiv fără a mişca viza macrometrică. Completarea punerii la punct se face numai cu viza micrometrică. [pic]
LUCRARE PRACTICA II.
PREGĂTIREA ŢESUTURILOR PENTRU EXAMINAREA MICROSCOPICĂ
Cel mai obişnuit procedeu folosit pentru studiul celulelor este prepararea de secţiuni tisulare ce pot fi studiate cu ajutorul microscopului optic. Prin microscopie optică, celulele sunt examinate prin transiluminare. Deoarece ţesuturile şi organele sunt prea grosiere pentru a permite transiluminarea lor, s-au dezvoltat o serie de tehnici pentru obţinerea de secţiuni fine, translucente. În unele cazuri straturi foarte fine de ţesut sau membrane transparente a unor animale vii pot fi observate la microscop fără secţionare prealabilă a ţesutului. În aceste cazuri este posibil studiul acestor structuri pentru perioade îndelungate şi în diverse condiţii fiziologice şi experimentale. Dacă se doreşte realizarea unui preparat permanent, fragmente mici din diverse structuri pot fi fixate, întinse pe lame de sticlă, colorate şi montate cu rezină, apoi examinate la microscop. În majoritatea cazurilor, ţesuturile necesită o secţionare foarte fină înainte de a fi examinate. Aceste secţiuni sunt realizate cu precizie de instrumente denumite microtoame, iar organul sau ţesutul trebuie păstrat şi pregătit pentru secţionare.
A. Recoltarea. Este o etapă foarte importantă deoarece, de multe ori, de această etapă depinde calitatea şi valoarea unei lame microscopice. Artefactele, structuri care apar ca urmare a unor greşeli de tehnică, pot apare deseori din cauza unei recoltări incorecte. În general, recoltarea se face prin două proceduri: 1. Biopsia, constă din recoltarea piesei dintr-un ţesut, organ sau organism viu. Este cea mai recomandabilă procedură de recoltare deoarece, se ştie, structura unui ţesut sau a celulelor se alterează foarte rapid după moartea celulară. Biopsia se poate realiza prin intervenţie chirurgicală, raclarea mucoaselor (bucală, vaginală etc.), puncţie bioptică din organe parenchimatoase (splină, ficat, rinichi) sau din măduva osoasă, aspiraţie endoscopică (căi respiratorii sau digestive). 2. Necropsia, constă din recoltarea piesei de la un organism mort. Se practică în situaţii speciale, în laboratoarele de anatomo-patologie, medicină legală etc. Nu este recomandabilă pentru studiile de cercetare ştiinţifică. Volumul piesei recoltate nu trebuie să depăşească 1 cm3.
B. Fixarea 1. Pentru a evita digestia celulelor de către enzime (autoliza) sau bacterii şi pentru a păstra structura, piese din organul examinat necesită un tratament prompt şi adecvat înainte sau imediat după îndepărtarea din corp. a. Acest tratament – fixare – constă, de obicei, în scufundarea ţesuturilor în agenţi stabilizatori sau prin perfuzarea organelor cu aceste substanţe pentru a menţine pe cât posibil caracteristicile morfologice şi moleculare ale ţesuturilor respective.
|Tabel 1-1. Etapele de preparare tisulară pentru examinare în microscopia optică |
|Etapa |Scop |Durata |
|Fixarea in fixatori simpli sau compuşi (amestec Bouin) |Pentru a păstra morfologia tisulară şi compoziţia |Aproximativ 12 h, în funcţie de fixator şi mărimea |
| |moleculară |piesei |
|Deshidratarea în concentraţii graduale de etanol |Pentru a înlocui apa celulară cu solvenţi organici |6-24 h |
|(70%-100%) | | |
|Clarificare în benzen, xilen sau toluen |Pentru a impregna ţesuturile cu un solvent de parafină |1-6 h |
|Includere în parafină topită (58-60°C) |Parafina pătrunde în toate spaţiile intercelulare şi |½-6 h |
| |chiar în celule realizând o rigiditate a ţesuturilor | |
| |pentru secţionare | |
b. Substanţele chimice folosite pentru păstrarea ţesuturilor sunt denumiţi fixatori. (1) Unii fixatori (ex. clorura de mercur, acidul picric) realizează precipitarea şi coagularea proteinelor. (2) Alţii (ex. formalina, glutaraldehida) nu determină coagularea proteică. (3) Toţi fixatorii au atât efecte favorabile dar şi nefavorabile. Scopul este de a obţine amestecuri fixatoare ce combină efectele dorite şi minimalizează efectele nedorite. (a) Cel mai utilizat amestecuri sunt amestecul Bouin, compus din acid picric, formalina (o soluţie saturată, 37% formaldehidă în apă), acid acetic şi apă; şi formalina Zenker (amestecul Hely) ce conţine formalină, dicromat de potasiu, clorură de mercur şi apă. (b) Cei mai simpli fixatori folosiţi sunt soluţia salină de formalină 10% şi soluţia de glutaral-aldehidă tamponată 2-6%. 2. Procesul de fixare este complex şi nu este pe deplin cunoscut. Însă se cunoaşte faptul că formaldehida şi glutaraldehida reacţionează cu grupările aminice (NH2) ale proteinelor tisulare. Datorită rezoluţiei înalte oferite de microscopul electronic, este necesară în acest caz, o fixare mai bună pentru a păstra cu fineţe detaliile ultrastructurale. Pentru acest lucru, o procedură de dublă fixare a devenit procedura standard pentru studiile structurale de fineţe: prin folosirea unei soluţii de glutaraldehidă, urmată de cea de a doua fixare cu tetraoxid de osmiu. În timp ce glutaraldehida realizează cross-link-ul proteinelor, scopul tetraoxidului de osmiu este de a fixa şi colora lipidele şi proteinele.
C. Includerea 1. Pentru a obţine secţiuni folosind microtomul, ţesuturile trebuie infiltrate, după fixare, cu substanţe de includere ce induc ţesutului respectiv o consistenţă rigidă. a. Aceste substanţe sunt gelatina, celoidina, parafina, şi cele mai recente, rezinele plastice. b. Parafina este folosită de rutină pentru microscopia optică; rezinele de tip epoxy (Epon sau Araldite) sunt folosite pentru microscopia electronică. 2. Procesul de includere sau de impregnare tisulară este de obicei precedat de 2 etape: spălare şi deshidratare. a. În prealabil, apa existentă în fragmente este extrasă prin tratări succesive în amestecuri de concentraţii diferite de etanol şi apă (de obicei de la etanol 70% la etanol 100%). b. Etanolul este apoi înlocuit de un solvent dizolvabil în mediul de includere. În cazul includerii cu parafină, solventul este xilena. (1) În timp ce ţesuturile sunt infiltrate cu solvent, de obicei acestea devin transparente. Odat impregnat cu solvent, ţesutul este plasat în parafină topită de obicei la 58-60°C. Căldura determină evaporarea solventului, şi spaţiile sunt umplute de parafină. (2) Ţesuturile incluse pentru microscopia electronică sunt de asemenea deshidratate in soluţii de etanol şi ulterior infiltrate cu solvenţi plastici cum este oxidul de propilenă. Aceşti solvenţi sunt miscibili cu şi apoi înlocuiţi de soluţii plastice (Epon, Araldite).
D. Secţionarea 1. Blocurile de parafină ce conţin ţesuturile sunt secţionate de lama de oţel a microtomului la grosimea de 1-20 μm. Secţiunile sunt apoi plasate pe lame de sticlă. a. Pentru microscopia electronică, sunt necesare secţiuni mult mai fine (0,02-0,1 μm) şi includerea se realizează printr-un plastic dur de tip epoxy. Blocurile obţinute sunt atât de dure, încât pentru secţionarea lor sunt necesare lame de sticlă sau diamant. b. Deoarece fasciculul de electroni nu poate penetra sticla, secţiunile extrem de fine sunt plasate pe un cadru de metal (de obicei de cupru). Acele porţiuni ale secţiunii ce se evidenţiază printre ochiurile cadrului pot fi examinate la microscopul electronic. 2. Imersia ţesuturilor în solvenţi, cum este xilena, dizolvă lipidele celulare, ceea ce este un efect nedorit, atunci când dorim studierea acestor componente. a. Pentru a preveni pierderea de lipide, se foloseşte criomicrotomul cu ajutorul căruia, ţesuturile devin consistente la temperaturi scăzute pentru a determina rigiditatea necesară secţionării. b. Criomicrotomul – şi succesorul său, mai eficient, criostatul – permit ca secţiunile să fie obţinute rapid fără a necesita procedura de includere descrisă anterior. c. Acestea sunt adesea utilizate în clinică, deoarece permit studiul rapid a specimenelor patologice în timpul procedurilor chirurgicale. Sunt de asemenea eficiente în studiile de histochimie a unor enzime foarte sensibile sau a unor molecule mici, deoarece îngheţarea nu inactivează enzimele şi previne difuziunea micromoleculelor.
E. Colorarea 1. Cu câteva excepţii, majoritatea ţesuturilor sunt incolore, astfel că observarea lor la microscopul optic este dificilă. Astfel au fost elaborate diverse metode de colorare ce nu doar realizează evidenţierea diverselor componente tisulare, dar permit şi diferenţieri între diversele ţesuturi. a. Colorarea se realizează prin folosirea de amestecuri ce colorează selectiv componentele tisulare. b. Majoritatea coloranţilor se comportă ca şi compuşi acizi sau bazici şi au tendinţa de a forma legături electrostatice cu radicalii ionizabili ai ţesuturilor. c. Componentele tisulare ce se colorează cu coloranţi bazici sunt denumite bazofile, iar cele cu afinitate faţă de coloranţii acizi sunt denumite acidofile. (1) Exemple de coloranţi bazici sunt albastru de toluidină şi albastru de metilen. Hematoxilina se comportă ca şi un colorant bazic, adică colorează componentele celulare bazofile. Principalele compomente celulare realizează legături ionice şi reacţionează cu coloranţii bazici datorită compoziţiei în acizi a acestora (nucleoproteine şi glicozaminoglicani). (2) Coloranţii acizi (ex. orange G, eozina, fucsina) colorează componentele bazice prezente în proteinele citoplasmatice. (3) Dintre toţi coloranţi, combinaţia hematoxilinei cu eozina (HE) este cea mai utilizată.
|Tabel 1-2. Exemple de tehnici de colorare |
|Tehnica |Componente |Nucelu |Citoplasma |Colagen |Fibre elastice |Fibre reticulare |
|Hematoxilin-eozină |Hematoxilină şi eozină |Albastru |Roz |Roz |Variabil | |
|Colorare elastică Weigert |Rezorcină şi fucsină, HCl, |Gri |Galben |Roşu |Negru | |
| |hematoxilină, acid picric, acid| | | | | |
| |acetic glacial | | | | | |
|Impregnare argentică |Soluţie salină de argint | | |Maro închis | |Negru |
2. O multitudine de alţi coloranţi sunt utilizaţi în diverse procedee citologice. Cu toate că sunt folositoare pentru vizualizarea diverselor componente celulare, de obicei nu realizează o analiză a compoziţiei chimice a celulelor studiate. Pe lângă colorare, impregnarea cu metale, de tipul argintului sau aurului este o tehnică mult mai utilizată, în special în studii ale sistemului nervos. 3. În microscopia electronică, imaginea formată se datorează capacităţii celulelor sau colorantului de a absorbi sau a împrăştia electronii. Săruri de metale grele cum ar fi citratul de plumb şi acetatul de uraniu, determină o absorbţie ridicată a electronilor sau o capacitate de refracţie şi sunt coloranţii de bază folosiţi în microscopia electronică.
F. Montarea şi etichetarea 1. Se realizează prin redeshidratarea secţiunilor în băi de alcool etilic de concentraţii crescătoare, de la 70° la alcool absolut şi apoi prin introducerea lamelor cu secţiuni într-o baie de xilol sau toluol. În continuare, se pune o picătură de balsam de Canada în zona secţiunilor de pe lamă şi se acoperă această zonă cu una sau două lamele care se apasă uşor pentru îndepărtarea bulelor de aer. Se pune preparatul la uscare pentru solidificarea balsamului, ceea ce se petrece în câteva zile la temperatura camerei. 2. Se lipeşte la un capăt al lamei o bucăţică de hârtie pe care se scrie numele organului sau ţesutului, organismul de la care provine, metoda de colorare folosită şi eventual data confecţionării şi numele executantului.
Celulele se află în organism fie agregate în diferite ţesuturi, fie în suspensie, în diferite lichide biologice. În funcţie de aceasta, prepararea lor pentru observarea la microscopul optic se face în mod diferit. Deşi varietatea metodelor este foarte mare, ele au câte un principiu comun aplicat în cele două situaţii de mai sus. Suspensiile celulare, de origine biologică (sângele, lichidul cefalorahidian, urina, lichidul pleural etc.) sau cele obţinute în condiţii de laborator (suspensii de celule obţinute prin dispersia unui ţesut sau din culturi celulare), nu necesită folosirea procedurilor complicate care implică secţionarea deoarece celulele, dacă sunt dispuse într-un strat subţire, sunt transparente. Întinderea unui strat subţire de celule pe suprafaţa unei lame microscopice formează un frotiu. După prepararea sa, frotiul de obicei se usucă şi se fixează cu soluţii fixatoare specifice. În funcţie de scopul propus, urmează apoi o colorare specifică, spălare, uscare, după care lama poate fi observată la microscop. În majoritatea cazurilor această tehnică este cea mai simplă metodă de preparare a celulelor pentru observarea Ia microscop. 1. Materiale necesare: lame de sticla degresate şi uscate, apă distilată, baie de colorare, soluţie May-Grünwald, soluţie Giemsa, sânge recoltat pe anticoagulant sau prin puncţia pulpei degetului; spirt medicinal, vată, ace sterile, seringi sterile, hemostilete. a. Prepararea soluţiei May-Grunwald. Soluţia reprezintă o combinaţie de fixator şi colorant format din soluţie saturată de metilene blue-eozinat în metanol. Colorantul se prepară conform reţetei lui Jenner după cum urmează: (1) se amestecă părţi egale de soluţie apoasă de 1,25% eozină şi 1% metilene blue (2) se filtrează după 24 ore (3) se spală filtrul cu apă distilată (4) pulberea rămasă pe filtru se usucă şi se dizolvă în 200 ml alcool metilic absolut, -Soluţie Giemsa b. Prepararea soluţiei Giemsa. Soluţia stoc se poate obţine ca atare de la diferite firme specializate sau se poate prepara după cum urmează: (1) colorant Giemsa (Azure-Eosine-Methylene blau), 1,52 g (2) glicerina anhidră, 100 ml, se dizolvă prin mojarare (3) alcool metilic absolut, 100 ml (4) se lasă în repaus 24 ore (5) se filtrează (6) se foloseşte în concentraţie de 5-10% (preparată în momentul folosirii) în apă distilată neutră sau în tampon fosfat neutru (pH 7,2)
2. Tehnica de lucru a. Se recoltează câţiva mililitri de sânge prin puncţie venoasă, pe un anticoagulant (citrat sodic, EDTA, heparină). Sângele astfel recoltat se foloseşte pentru executarea frotiului. Nu se recomandă folosirea sângelui consevat mai mult de 24 ore deoarece, după acest interval de timp, leucocitele îşi modifică morfologia sau se lizează. b. O variantă mult mai simplă constă din recoltarea sângelui prin puncţia pulpei degetului cu un ac steril sau cu un hemostilet. În acest caz se foloseşte picătura de sânge care apare la nivelul înţepăturii. c. O picătură de sânge recoltat se dispune la extremitatea unei lame microscopice. Cu o altă lamă, ţinută oblic, se atinge picătura de sânge în aşa fel încât aceasta să se întindă de-a lungul întregii muchii a acesteia. Apoi, rapid, se deplasează această lamă până Ia extremitatea opusă a primei lame. Se realizează astfel un strat subţire de sânge, care reprezintă frotiul sanguin. Calitatea unui frotiu este corespunzătoare dacă celulele sunt dispuse într-un singur strat continuu şi depinde de mai mulţi factori: mărimea picăturii de sânge, unghiul sub care se ţine lama cu care se trage frotiul, viteza de întindere a frotiuiui. Frotiul realizat se usucă la aer. d. Colorarea frotiului se face după tehnica May-Grünwald-Giemsa. În prima etapă, lamele cu frotiul uscat, dispuse pe suportul unei băi de colorare se acoperă cu un strat de soluţie May-Grünwald (2-3 ml). Se lasă 5 minute, timp în care alcoolul metilic din compoziţia soluţiei realizează fixarea celulelor din frotiu. Apoi, deasupra stratului de soluţie May-Grünwald, se toarnă aceeaşi cantitate de apă distilată neutră şi se amestecă uşor cu ajutorul vârfului unei pipete Pasteur. Se lasă încă 5 minute, timp în care soluţia acţionează ca şi colorant. e. După expirarea timpului de 5 minute, se aruncă soluţia May-Grünwald de pe frotiuri şi fără a le spăla, acestea se acoperă cu soluţie Giemsa 10%, preparată în momentul folosirii. Colorantul Giemsa realizează colorarea nucleilor celulari, iar timpul de colorare variază în funcţie de calitatea colorantului (în medie, între 10 şi 30 min.) f. După expirarea timpului de colorare, frotiurile se spală cu apă de robinet şi apoi se acoperă pentru 1 min. cu apă distilată pentru, diferenţierea coloraţiei. Se usucă la temperatura camerei sau la curent de aer cald. g. Observarea se face, pentru o imagine de ansamblu cu obiectivul 10x sau 20x, iar pentru detalii,, cu obiectivul de imersie. De notat că observarea cu obiectivul de imersie se face fără a se acoperi frotiul cu lamela, uleiul de imersie neafectând celulele de pe frotiu. Se recomandă ca observarea să se facă pe marginea frotiului, deoarece aici celulele sunt dispuse într-un singur strat, iar leucocitele au morfologia neafectată. 3. Rezultate. Un frotiu este bun dacă îndeplinesc următoarele condiţii: a. este foarte subţire, cu celulele dispuse într-un singur strat b. are ambele margini pe lamă c. porţiunea terminală este rotunjită, prezentând franjuri d. este întins uniform, fără îngroşări sau întreruperi e. Celulele eritrocitare, neavând nucleu apar cu conţinutul omogen, colorat în cenuşiu, cu nuanţe roşii-albăstrui. Leucocitele, mult mai rare, apar bine evidenţiate, cu nucleul colorat în roşu. La sângele normal, aspectul general al unei imagini precum şi tipurile de leucocite sunt reprezentate în Tabelul 1-3.
| | |Tabel 1-3 |
|Elementele celulare din sângele uman |
|Element sanguin |Tip celular |Procentaj |
|[pic] |Eritrocite |4,5-5 mil./mm3 |
| |- Transportul gazelor respiratorii | |
|[pic] |Granulocite neutrofile |50-70% |
| |- microfagocitoză în infecţii bacteriene |(3000-4500/mm3) |
|[pic] |Granulocite bazofile |0-1% |
| |- Valorile se modifică în procesele tumorale |(10-20/mm3) |
|[pic] |Granulocite eozinofile |1-4% |
| |- Cresc în stări alergice şi parazitare |(100-200/mm3) |
|[pic] |Limfocite |30-45% |
| |- Infecţii bacteriene şi virale |(1250-2400/mm3) |
|[pic] |Monocite |4-8% |
| |- Se transformă în macrofage şi intervin în infecţii |(240-480/mm3) |
| |prin fagocitoză | |
LUCRAREA NR.4
Studiul elementelor figurate ale sîngelui în coloraţia MGG
Sînt reprezentate prin 3 grupe: I. Globule roşii ( hematii, eritrocite ) II. Globule albe ( leucocite ) A. Granulocite ( polinucleare ) 1. neutrofile 2. eozinofile ( acidofile ) 3. bazofile B. Agranulocite ( mononucleare ) 1. limfocite 2. monocite III. Trombocite ( plachete sangvine )
I. Hematiile - sînt elemente anucleate colorate în roşu cărămiziu Nr.: la femei 4 – 4,5 milioane/mm3 sînge la bărbaţi 4,5 – 5 milioane/mm3 sînge Diametrul : celulei vii 8,6 microni după uscare şi fixare 7,5 microni Forma: din faţă: rotunde şi prezintă o margine mai intens colorată decît porţiunea centrală din profil: disc biconcav asigurînd o suprafaţă mai mare pentru schimburile gazoase
II. Leucocitele
A. Polinucleare
1. Neutrofile Procent în formula leucocitară: 60-68% Dimensiuni: 12-14 microni Se caracterizează prin: citolasmă: ❖ acidofilă ( colorată în roz pal), bogată în granulaţii fine colorate în roz – violet, îngrămădite în toată citoplasma nucleul: ❖ prezintă 2-5 lobi, uniţi prin filamente de cromatină ( aparent polinucleari! ) ❖ într-un procent redus de 1-3% se găsesc leucocite cu nuclei nelobaţi, nesegmentaţi în formă de bastonaş sau asemămător unor litere din alfabet I, S, G, V ( caracteristic elementelor tinere) ❖ paralel cu gradul de îmbătrînire sau în unele intoxicaţii nucleii devin hipersegmentaţi Rol: intervin în faza timpurie a infecţiilor bacteriene prin microfagocitoză
2. Eozinofile Procent în formula leucocitară: 2-4% Dimensiuni: 12-17 microni Se caracterizează prin: citoplasmă: ❖ acidofilă colorată în roz-violaceu ❖ conţine granulaţii acidofile ( colorate în roşu-cărămiziu) toate rotunde, egale ca mărime şi uniform repartizate în citoplasmă, mascînd uneori nucleul nucleul: ❖ cel mai frecvent este bilobat, avînd aspect de desagă ( 2 lobi uniţi printr-un filament cromatic fin) Rol: cresc numeric în afecţiuni alergice şi parazitare
3. Bazofile Procent în formula leucocitară: 0,5% ( sînt rare în frotiul sangvin normal) Dimensiuni: 8-12 microni Se caracterizează prin: citoplasmă: ❖ colorată în roz palid ❖ conţine granulaţii bazofile (colorate în albastru) caracterizate prin forme variate ( rotunde, colţuroase ), mărimi variate ( inegale ) şi repartizate neuniform în citoplasmă nucleul: ❖ parţial segmentat are aspect de trifoi Rol: cresc numeric în procese tumorale, boli virale, în urma expunerii la radiaţii
B. Mononucleare
1. Limfocite Procent în formula leucocitară: 25-35% Dimensiuni: 6-15 microni Se caracterizează prin: citoplasmă: ❖ bazofilă colorată în albastru deschis ( aspect de cer senin ) nucleul: ❖ are formă sferică sau uşor scobit ❖ conţine cromatină grunjoasă, puternic colorată în violaceu închis ( aspect de pată de cerneală ) ocupă caracteristic aproape toată celula, astfel încît citoplasma e slab reprezentată sub forma unei semilune la periferia celulei Rol: creşterea numerică ( limfocitoza ) apare în infecţii bacterine cronice ( tuberculoză ), virale, leucemia limfocitară iar limfopenia apare în infecţii grave, unele intoxicaţii, iradiere
2. Monocite Procent în formula leucocitară: 3-8% Dimensiuni: 15-25 microni ( sînt leucocitele cele mai mari ) Se caracterizează prin:
citoplasmă: ❖ bazofilă colorată în albastru - gri ( aspect de fum de ţigară ) nucleul: ❖ scobit, reniforrm ( aspect de boabă de fasole ) ❖ conţine cromatină pulverizată Rol: în procesele de fagocitoză
III. Trombocitele ❖ sînt elemente figurate anucleate, provenite din fragmentarea megacariocitelor din măduva hematogenă ❖ nr: 200.000-400.000/mm3 sînge ❖ diametru: 2-4 microni ❖ au formă neregulată, uneori ovoidală ❖ apar frecvent în cuiburi, aglutinate printre celelalte elemente figurate ❖ la microscop prezintă o zonă centrală, granulară ( granulomer ) colorată în violet şi o zonă periferică, omogenă ( hialomer ) uşor bazofilă ❖
LUCRAREA PRACTICA 5
ALTE TIPURI DE MICROSCOPIE OPTICA
Microscopia în contrast de fază 1. Majoritatea obiectelor biologice observate la microscop sunt transparente şi de aceea pentru observarea lor ele trebuie în prealabil colorate (contrastate), astfel încât diferitele elemente structurale să se coloreze (contrasteze) diferit. A alege o astfel de colorare este de obicei dificil. Dar şi ţesuturile (structurile) necolorate sunt optic neomogene, deoarece au un indice de refracţie a luminii diferit. De aceea între razele care traversează partea structurii cercetate cu indicele de refracţie n1 şi zona cu indice de refracţie n2 va apărea o anumită diferenţă de fază. Această diferenţă de fază nu se manifestă direct, deoarece diferenţele de drum optic sau modificările în faza undelor de lumină produse de către aceste obiecte sunt prea mici ca să fie detectate de ochi sau pe fotografie. [pic] a. În microscopia în contrast de fază diferenţele de drum optic sunt amplificate, deoarece razele refractate sunt defazate la trecerea printr-un dispozitiv special numit placă de fază. b. După cum se observă în figura I-10, razele de lumină ajung la preparat, de aici la obiectiv şi apoi la placa de fază care este prevăzută cu un şanţ inelar. Raza nerefractată trece prin inelul plăcii de fază, care o defazează cu 1/4 faţă de raza refractată ce nu trece prin acest inel. La formarea imaginii se produce interferenţa celor două raze. c. Interferenţa dintre razele normale şi cele defazate duce la o mărire a contrastului la limita dintre două zone cu indici de refracţie foarte puţin diferiţi. Rezultatul este apariţia unui halou ce creşte contrastul şi permite observarea unor detalii invizibile la microscopul optic simplu. Pentru fiecare obiectiv există o placă de fază, ce se aduce în axa optică prin rotirea tamburului pe care se află montate plăcile de fază. d. Microscoapele folosite în această tehnică au în componenţa lor o trusă specială care conţine elementele necesare pentru examinarea în contrast de fază: condensori pentru contrast de fază (care conţin şi placa de fază), obiective pentru contrast de fază, microscop ocular pentru centrarea condensorilor faţă de obiective şi chei speciale pentru reglarea (centrarea) condensorilor. e. Microscopia în contrast de fază este folosită pentru studiul celulei vii, permiţând observarea structurii nucleului, distribuţia organitelor în citoplasmă, modificările din diviziunea celulei, mişcările celulare. Adesea se procedează la filmare prin cuplare la microscop a unui aparat destinat acestui scop. f. Această metodă specială utilizată la microscoapele moderne, este adecvată pentru observarea obiectelor (preparatelor) transparente care nu absorb lumina, ci doar introduc în razele de lumină diferenţe de drum optic. 2. Aplicaţii practice a. studiul celulelor în stare vie (celule nefixate şi necolorate); b. scoate în evidenţă unele detalii de structură care nu se pot observa la microscopul fotonic obişnuit ca endocitoza, mişcarea cililor şi flagelilor, diviziunea celulară, etc.; c. studiază reacţiile celulare la diferiţi agenţi fizici sau chimici; d. studiază benzile cromosomilor. 3. Preparat de examinat în contrast de fază a. Materiale: microscop în contrast de fază; frotiu de mucoasă bucală, cultură de celule în monostrat sau o suspensie de protozoare pe o placă petri. b. De studiat: folosind figura ca şi ghid, familiarizaţi-vă cu componentele microscopului cu contrast de fază. Observaţi componentele asemănătoare cu ale microscopului optic uzual, cu diferenţa că acestea sunt inversate. c. Plasaţi fie frotiu de mucoasă bucală, fie o cultură de celule în monostrat sau chiar o placă petri ce conţine o suspensie de protozoare pe platina microscopului. d. Observaţi celulele la microscopia uzuală şi în contrast de fază. Notaţi posibilele mişcări sau unele schimbări ale celulelor, după o perioadă de timp, inclusiv unele schimbări la nivelul materialului nuclear al celulelor cultivate. e. În cazul frotiului de mucoasă bucală se observă celule izolate sau în grupuri de câte 2-4, care prezintă nucleul dispus central de forma rotundă sau uşor alungită în care se observă heterocromatina mai închisă la culoare situată mai ales la periferie. În citoplasmă se observă granule de diferite forme şi mărimi dispuse în jurul nucleului, iar sub plasmalemă un inel mai clar din care lipsesc granulele.
Microscopia în lumină polarizată 1. Tehnică prin care se obţin imagini ale unor constituienţi în care structurile examinate sunt anizotrope, acestea făcând ca viteza de propagare a luminii polarizate să varieze cu direcţia de propagare; mediile respective se numesc birefringente. [pic] a. Clasificări ale birefringenţei: (1) în structurile fibrilare (colagen, mielină, fibrele musculare striate, etc.) poate exista o birefringenţă pozitivă când indicele de refracţie este mai ridicat în lungime decât în plan perpendicular şi birefringenţă negativă, în caz contrar (fibrele nucleoproteice). (2) birefringenţa cristalină sau intrinsecă observată în sistemele sau moleculele în care ionii prezintă un aranjament asimetric regulat şi este independentă de indicile de refracţie a mediului de montare; se observă în structuri constituite din proteine sau lipide; (3) birefringenţa de formă sau structură apare atunci când particulele submicroscopice sunt orientate regulat într-un mediu cu indice de refracţie diferit; (4) birefringenţa de tensiune se observă la structurile izotrope care sunt supuse unei constrângeri mecanice şi se întâlneşte la nivelul muşchilor şi în ţesuturile embrionare; (5) dicroismul apare în momentul în care absorbţia unei lungimi de undă dată de lumina polarizată variază în funcţie de orientarea obiectului examinat. b. Aceste variaţii apar datorită diferenţelor de intensitate (amplitudinea luminii transmise de obiect). Unii coloranţi organici ca roşul de Congo sau thionina, pot induce dicroismul în unele structuri biologice datorită unei orientări preferenţiale a moleculelor. 2. Microscopul cu lumină polarizată a. Prezintă două dispozitive speciale numite: polarizor şi analizor; ele sunt constituite dintr-o peliculă de film polaroid sau dintr-o prismă Nicol. b. Polarizorul se găseşte sub condensator iar analizorul se afla deasupra obiectivului. c. Dacă planul de polarizare al analizorului este perpendicular pe cel al polarizorului, lumina nu va fi transmisă. Punând pe platina microscopului un preparat birefringent, planul de polarizare va devia datorită întârzierii provocate de întreruperea probei de examinat. Învârtim preparatul până când în câmpul microscopului apar puncte cu luminozitate maximă şi minimă. d. Tehnica: se coboară tubul microscopului apropiind obiectivul de condensor până la obţinerea unei iluminări maxime şi uniforme a câmpului microscopic; se rotesc cei doi nicoli – analizorul şi polarizorul – până când se obţine întunecarea maximă în câmpul ocularului; pe platina microscopului se aşează o lamă port obiect pe care sunt secţiuni din rinichi, intestin sau ficat, colorate după metoda topo-optică Romanyi (materialul se fixează în formol, se secţionează la microtomul de congelare iar secţiunile se colorează cu o soluţie de albastru de toluidină la pH 4,5 urmând o post fixare cu fericianid de potasiu care are capacitatea de a se lega de lipidele şi glicoproteinele din structura biomembranelor); 3. Aplicaţii practice a. se pot studia structurile a căror compoziţie chimică macromoleculară au un aspect liniar, ca de exemplu fibrele de colagen, mielina, fibrele musculare striate; b. se utilizează pentru studiul structurilor: membrane biologice; c. se evidenţiază structurile cu simetrie radială: granule proteice, lipide, colesterol.
LUCRAREA PRACTICA 6
ALTE TIPURI DE MICROSCOPIE OPTICA
Microscopia pe fond întunecat şi ultramicroscopia 1. Se bazează pe fenomenul Tyndall, care constă în dispersia (împrăştierea) luminii de către particule foarte mici aflate în suspensie şi care astfel devin vizibile, analog particulelor de praf aflate într-o rază de lumină puternică. 2. În acest caz se foloseşte o metodă de iluminare în care fascicolul care serveşte la iluminarea obiectului nu pătrunde direct în microscop. a. Proba este iluminată cu raze oblice printr-un condensor special (cardioid sau paraboloid), iar în obiectiv nu pătrund decât razele dispersate de particule aflate în suspensie. b. Fascicolul incident este în fiecare caz limitat de o diafragmă (D) cu deschideri convenabil alese. Astfel apar nişte puncte strălucitoare pe fond negru, ce corespund particulelor până la 0,003 mm, deci de aproape 1000 ori mai mici decât limita de rezoluţie a microscopului optic. Se pot astfel observa particule în citoplasmă celulelor vii, care nu pot fi văzute în microscopia obişnuită. 3. Microscopia pe fond întunecat se foloseşte şi pentru examenul celulelor vii (microbi, protozoare) care pot fi văzute şi la microscopul obişnuit, dar ale căror particularităţi apar cu mult mai clar pe fond întunecat. De exemplu studiul spirochetelor permite diagnosticul unor boli printre care şi sifilisul. a. Pe de altă parte se practică şi pentru preparate cu contrast slab. Imaginea preparatului apare luminoasă pe fond întunecat. Acest procedeu are la bază efectul produs de condensor, datorat fenomenului de difracţie a luminii (în preparat) realizat printr-o iluminare laterală. b. Examinarea pe fond întunecat se poate face şi la un microscop obişnuit, la care preparatul cu particule în suspensie se plasează într-o cuvă de sticlă iluminată lateral. Acest procedeu se numeşte ultramicroscopie. (1) După prezenţa cercului se va putea constata prezenţa particulei şi mişcarea ei. (2) Particulele se văd ca nişte steluţe sclipitoare pe fond întunecat. (3) Ultramicroscopia permite observarea unor particule cu dimensiuni de până la 0,003 m (30 Å). c. De remarcat că pe măsură ce ne apropiem de limita de rezoluţie a microscopului dispare asemănarea dintre obiect şi imagine din punct de vedere geometric. Aceasta se aplică şi la microscopia pe fond întunecat şi la ultramicroscopie. 4. Preparat de examinat pe fond întunecat a. Celule cultivate de Spirulina platensis (algă verde-albastră). b. De studiat: celule unite între ele într-o structură de formă spirală, strălucitoare pe fond negru, care se roteşte încet în jurul axei sale.
Microscopia de fluorescenţă 1. Prin absorbţia energiei luminoase moleculele trec din starea fundamentală în starea excitată. Revenirea moleculei la starea fundamentală se produce prin pierderea energiei. În cazul fluorescenţei, revenirea la starea fundamentală se însoţeşte de emisie de radiaţie luminoasă ce are o energie inferioară radiaţiei absorbite, adică lumina emisă are lungimea de undă mai mare. a. Substanţele ce prezintă fluorescenţă puternică se numesc fluorocromi. (1) În microscopia de fluorescenţă preparatele examinate conţin fluorocromi. (2) Prin iradierea cu lumină ultravioletă se produce excitarea fluorocromilor şi rezultă fluorescenţa zonelor ce conţin fluorocromii. b. Microscopul de fluorescenţă are ca sursă de lumină o lampă cu vapori de mercur ce emite radiaţii ultraviolete. (1) În calea razelor ultraviolete se aşează filtre de excitaţie (colorate în albastru până la violet) ce opresc o parte din radiaţiile sursei lăsând să treacă numai pe cele cu lungimea de undă care să excite fluorocromul. (2) Radiaţia trece apoi prin condensor, obiectiv, lama cu preparatul microscopic, toate din sticlă de cuarţ fiindcă sticla obişnuită absoarbe razele ultraviolete. (3) După trecerea prin obiectiv lumina este filtrată prin filtre de baraj care opresc lumina ce vine de la sursă şi permit numai trecerea luminii emise de fluorocrom. Imaginea este observată după ce lumina fluorescentă trece prin ocular. (4) Zonele fluorescente apar luminate pe fond întunecat. c. Microscopia de fluorescenţă se foloseşte pentru observarea unor preparate colorate vital, pentru observarea lizozomilor ce au acumulat coloranţi fluorescenţi (cum este acridin oranjul), în studiul cromozomilor (benzi fluorescente sau detectarea cromozomului Y), în studii de imunologie (imunofluorescenţă), de histochimie şi citochimie. d. Microscopia de fluorescenţă a fost folosită în biologia celulară în studiul mobilităţii proteinelor de membrană după fuziunea celulelor umane şi de şoarece, experienţă ce dovedeşte fluiditatea membranei. e. Precizări: Nu se va privi niciodată la microscopul cu fluorescenţă până nu ne-am convins că filtrele de baraj se află la locul lor, deoarece razele ultraviolete produc instantaneu leziuni retiniene severe. La pornirea lămpii microscopului cu fluorescenţă se aşteaptă cel puţin 15 minute, iar după oprirea lămpii este necesară o răcire de circa 2 ore înainte de a o aprinde. 2. Tehnica examinării în fluorescenţă. Examinarea preparatelor fluorescente se poate efectua prin transmisie sau prin reflexie (iluminarea de sus prin obiectiv). a. Procedeul pentru examinarea prin transmisie (transparenţă) presupune preparate care sunt transparente sau secţiuni din preparate pe care lumina le poate străbate. (1) Fluorescenţa este indusă în toată masa preparatului; ceea ce face posibilă examinarea preparatului, adică observarea zonelor fluorescente faţă de cele nefluorescente. (2) Procedeul se poate combina cu observarea structurii (imaginii) prin absorbţie (transparenţă) în lumină policromă din spectrul vizibil pentru a identifica structura şi zonele de interes. b. Examinarea prin reflexie (iluminarea de sus prin obiectiv) presupune inducţia fluorescenţei în primul rând pe suprafaţa preparatului. (1) Tehnica este combinată cu examinarea preparatului în lumină policromă din spectrul vizibil prin procedeul de transmisie pentru a putea identifica şi examina structura. (2) Este posibilă şi examinarea combinată la aceste tipuri speciale de microscoape. c. În microscopia de fluorescenţă preparatele sunt impregnate cu fluorocromi. Prin aceasta unele zone sau detalii de interes din preparat devin fluorescente atunci când sunt iradiate cu lumină ultravioletă în cadrul spectrului de absorţie. Pentru acest procedeu microscoapele de cercetare sunt echipate cu condensori speciali pentru lumină ultravioletă, obiective speciale. d. Există microscoape speciale pentru studii de fluorescenţă realizate pentru a examina preparatele utilizând iluminarea prin obiectiv (procedeul prin reflexie). (1) Sursa de lumină pentru producerea fluorescenţei este în general o lampă cu vapori de mercur (Hg) sau o lampă cu Xenon cu puterea de 200-1000 W. (2) Preparatele se depun pe lame de sticlă nefluorescente. Dacă se utilizează procedeul cu imersie atunci uleiul trebuie să fie nefluorescent. e. Procedeul. Radiaţiile ultraviolete emise de sursă (S) sunt filtrate de filtrul de excitaţie (FE) pentru a selecta lungimea de undă care să producă prin excitaţie fluorescenţa preparatului. (1) Lumina de excitaţie cu lungimea de undă λ1 cade pe prisma (Pr) cu reflexie totală şi care se află inclusă în obiectiv. Acest obiectiv special focalizează lumina de excitaţie (λ1) pe suprafaţa preparatului producând fluorescenţa. (2) Lumina fluorescentă emisă de preparat (λ2) ajunge la obiectivul (Ob) şi de aici la ocularul (Oc). Pentru ca lumina de excitaţie (λ1) eventual reflectată de preparat să nu ajungă pe retina ochiului ea este barată cu filtrul de baraj (FB) care se aplică sub ocular. Astfel observatorul vede numai lumina fluorescentă. (3) Zonele fluorescente apar luminoase pe fond întunecat aşa cum am mai arătat metoda se poate combina cu obsevarea prin transmisie a preparatului pentru a identifica structura. Pentru aceasta aparatul este dotat cu o sursă policromă în spectrul vizibil (S1) care este completată cu elementele sistemului prin transparenţă. f. Procedul este asemănător cu microscopia în lumină reflectată prin care se examinează preparatele la suprafaţă prin reflexia diferenţială a luminii datorată formei suprafeţelor. g. Această tehnică se poate utiliza pentru preparate netransparente cât şi pentru preparate transparente în combinaţie cu observarea structurii prin transparenţă. 3. Aplicaţii practice. a. Cu ajutorul fluorescenţei primare pot fi identificaţi: (1) pigmenţii: porfirinele (fluorescenţa roşie), lipocromii sau pigmenţii carotenoizi (fluoresecenţa verde), cromolipidele (fluorescenţă galben-verde), lipofuscina (fluorescenţă roşu-brun); (2) acizii aminaţi: fenilalanina, tirozina, triptofanul (fluorescenţa albastră); (3) unele virusuri şi bacilul Koch emit o fluorescenţă verde strălucitor; (4) dintele natural este autofluorescent, proprietate prin care se deosebeşte de cel artificial; (5) aminele biogene: adrenalina, noradrenalina, serotonina (fluorescenţă verde). b. Cu ajutorul fluorocromării cu acridin orange se pot identifica: (1) acizii nucleici: ARN-ul (fluorescenţa roşie), ADN-ul (fluorescenţă verde-galben); (2) fibrele de colagen, elastice şi de reticulină - fluorescenţa verde; (3) nucleii leucocitelor au o florescenţă verde iar citoplasma lor şi eritrocitele rămân opace; (4) mucinele - fluorescenţă verde. 4. Preparate de examinat în microscopia de fluorescenţă. a. Acizii nucleici în celulele hepatice (colorare cu acridin-oranj) (1) Acridin-oranjul colorează ADN-ul în verde iar ARN-ul în roşu. Astfel, nucleul, care conţine ADN, se va colora în verde, iar citoplasma şi nucleolii care conţin ARN, se vor colora în roşu. (2) Tehnica: Ficatul de şobolan, proaspăt recoltat se taie în bucăţi mici de circa 1 cm3, care se presează, în mai multe locuri, pe o lamă curată şi degresată. Lama se usucă la aer, după care se introduce în soluţie fixatoare de alcool metilic: acid acetic glacial (3:1), timp de 10-15 minute. Se colorează preparatul cu acridin-oranj prin introducerea lamei succesiv, în pahare Berzelius care au următorul conţinut: (a) apă distilată, 2 min; (b) acid ascorbic 0,1 M, 20 min. (are rolul de a prelungi fluorescenţa în timpul examinării); (c) acridin-oranj 0,01% în apă, 5 min.; (d) apă distilată, 2 min. (3) La urmă se aplică o picătură de apă cu pH 4,5, se acoperă cu o lamelă, după care lama este gata de examinare. (4) De studiat: celulele hepatice izolate sau în grupuri mici, care prezintă un contur neregulat (cu franjuri), de culoare roşie intensă, unul sau doi nuclei de culoare verde cu nucleoli roşii. Între celulele hepatice se mai pot observa celule albe sanguine care prezintă nucleul de formă neregulată şi culoare verde şi cu citoplasmă uşor roşie. b. Cromozomul Y (corpusculul F) în nucleii celulelor din mucoasa bucală colorat cu clorhidrat de chinacrină. (1) Tehnica: se prepară un frotiu de celule din mucoasa bucală după cum s-a descris la determinarea cromatinei sexuale. Frotiul se colorează cu soluţie de chinacrină prin introducerea lamei în pahare Berzelius care conţin următoarele soluţii: (a) alcool metilic şi acid acetic (3:1), 10-15 min.; (b) apă distilată, 2 min.; (c) acid ascorbic 0,1 M, 20 min.; (d) chinacrină 0,5%, pH 4,5 15 min.; (e) 3 băi de apă distilată, 10 minute în total (f) se usucă la aer. (2) Se montează lama cu apă având pH 4,5 şi se acoperă cu o lamelă, după care se examinează la microscop. c. Autofluorescenţa clorofilei în cloroplastele de Hydrilla sp. (1) Autofluorescenţa este proprietatea unor substanţe naturale de a emite radiaţii în spectrul vizibil atunci când sunt iluminate cu radiaţii ultraviolete. (2) Tehnica: Se pune o frunză de Hydrilla sp. pe o lamă într-o picătură de apă şi se acoperă cu o lamelă. În lumina albă cloroplastele din celulele frunzei au o culoare verde, pe când în lumină ultravioletă cloroplastele emit o fluorescenţă roşie.
LP. 6
Tehnici speciale de biologie celulară şi moleculară:
Microscopia electronică. Componentele microscopului elecronic. Principiul de funcţionare
Generalităţi
Forţarea barierelor invizibilului cu consecinţe aproape de nebănuit pentru ştiinţele biologice, s-a realizat după 1933, odată cu apariţia microscoapelor electronice. Microscopul electronic constituie un exemplu de felul cum au fost aplicate în practică unele din marile descoperiri făcute în fizică la sfârşitul secolului trecut: descoperirea razelor X, demonstrarea existenţei electronului, stabilirea caracterului ondulatoriu al electronilor şi asemănarea acestora cu fotonii, stabilirea rolului de funcţionare ca lentilă a câmpurilor electromagnetice cu simetrie axială asupra electronilor. Toate aceste descoperiri au dus la fundamentarea opticii electronice ce stă la baza construirii microscoapelor electronice a acceleratoarelor de particule, a tuburilor cinescopice.
Fizicianul francez Louis de Broglie a emis, în 1924, ipoteza că electronii au proprietăţi ondulatorii, adică le este asociată o undă, din acest punct de vedere asemănându-se cu fotonii. Această lungime de undă a electronului se numeşte „lungime de undă Broglie”. Prin aceasta de Broglie a demonstrat asemănarea dintre radiaţiile electronice şi cele luminoase.
În toate tipurile de microscoape electronice, electronii generaţi de un tun electronic şi supuşi unor tensiuni de accelerare, sunt focalizaţi şi dispersaţi pentru a forma o imagine prin trecerea lor prin câmpuri electrostatice sau electromagnetice în funcţie de tipul constructiv de microscop. Lungimea de undă a fasciculului de electroni este aleasă în funcţie de tensiunea de accelerare, de la 0,0859 Å la 20 kV, la 0,0028 Å la 400kV, permiţând explorări în microcosmosul celular până la nivel molecular. Cele mai perfecţionate microscoape electronice aflate în exploatare în diferite laboratoare au rezoluţii garantate de 2-3 Å (în condiţii speciale 1,2 Å şi putere maximă de mărire pe placa fotografică de 800 mii ori).
|[pic] |
|Fig. I-10 Shema formării imaginii în microscopia optică şi electronică (TEM şi SEM) |
Microscoapele electronice existente se împart după tipul de construcţie şi destinaţia lor în: i. Microscoape electronice de transmisie (TEM – Transmission Electron Microscope), utilizate pentru cercetări ultrastructurale. ii. Microscoape electronice de baleiaj (SEM – Scanning Electron Microscope), folosite la studiul ultramorfologiei suprafeţelor cu ajutorul electronilor secundari sau reflectaţi. iii. Microscoape electronice de transmisie şi baleiaj (STEM – Scanning Transmission Electron Microscope), ce permit studiul ultrastructural prin transmisie de electroni şi al suprafeţelor prin electroni secundari sau reflectaţi pe principiul SEM. iv. Microscoape electronice analitice de transmisie (TEAM) folosite pentru cercetări simultane ultrastructurale şi analitice. v. Microscoape electronice sistemice, aparate cu funcţionalitate de sistem ce permit cercetări multiple simultan pe acelaşi preparat. vi. Microscoape electronice cu fotoemisie (PEM – Photoelectron Emission Microscope) cu aceleaşi aplicaţii ca şi cele de tip SEM. vii. Microsonde electronice (EPI - Electron Probe Instrument) utilizate în analize elementare şi în studiul suprafeţelor. viii. Microscoape ionice cu emisie de câmp (FIM - Field Ion Microscope) cu ajutorul cărora se poate vizualiza direct orientarea atomilor într-un material.
1.2.1. Microscopia electronică de transmisie (TEM)
Microscopia electronică prin transmisie este determinată, pe de o parte de interacţiunea câmpurilor electromagnetice produse de lentile cu electronii, influenţând parametrii electronooptici şi, pe de altă parte de interacţiunea electronilor cu proba. Pentru ca electronii să poată tranversa proba este necesară o grosime suficient de mică a ei şi totodată energii de accelerare suficient de mari ale electronilor.
Astfel, deosebim microscoape electronice de transmisie convenţionale CTEM, a căror tensiuni de accelerarea electronilor sunt cuprinse între 20-125 kV (pentru probe biologice se folosesc în mod curent tensiuni de 80 kV) şi microscoape de voltaj înalt (HVEM), ale căror tensiuni ajung la 3 MV (3000 kV) şi chiar mai mult.
O secţiune transversală printr-un microscop electronic relevă o serie de elemente constructive ca: sistemul de vidare, tunul electronic, camera probei, ecranul fluorescent, dispozitivul de fotografiere şi blocurile speciale pentru alimentarea electrică.
Datorită complexităţii sale tehnologice de a menţiune un fascicul de electroni cu un diametru de 1-2 µm în condiţiile de paraxialitate impuse de legile opticii pe o lungime de cel puţin un metru, putem distinge în cadrul microscopului electronic mai multe etaje, la fel de importante în funcţionarea lui. Astfel, evidenţiem: A. sistemul electronooptic; B. sistemul electronic şi consola de comadă; C. sistemul de vid.
Sistemul electronooptic
Sistemul electronooptic sau sistemul responsabil de realizarea imaginii, localizat în coloana microscopului, este alcătuit din: sistemul de iluminare, camera pentru preparat, sistemul de formare a imaginii, camera de observaţie şi camera fotografică.
Principial, realizarea imaginii la microscopul electronic nu diferă de microscoapele obişnuite, fotonice.
Astfel, ca şi la microscopul fotonic, este necesară o sursă de radiaţii tot de natură electromagnetică, aşa numita radiaţie X a cărei lungime de undă este însă de 105-106 mai mică decât a radiaţiei verzi, aflată la jumătatea spectrului vizibil, deci sub 0,1 Å ceea ce va permite detalieri morfostructurale de ordinul angstromului. Reamintim că scara de 1 Å este scara atomică.
Sistemul electronic şi consola de comandă
Sistemul electronic, deosebit de important, este alcătuit în principal la microscoapele moderne din două blocuri: unul responsabil de realizarea unei tensiuni înalte, bine stabilizate, care să permită obţinerea rezoluţiei propuse, sub 10 Å, al doilea fiind responsabil de realizarea unui curent bine stabilizat pentru alimentarea lentilelor, micşorând pe cât posibil aberaţiile lor. Evident că accesarea luminii, rezoluţiei şi clarităţii imaginii se realizează electronic prin consola de comandă situată pe un panou frontal.
Sistemul de vid
Pentru a împiedica interacţiunile dintre radiaţiile X şi moleculele de aer, deci obţinerea unui fascicul coerent cu o deplasare perfect rectilinie până la ecranul fluorescent, este necesară realizarea în coloana microscopului a unui vid înalt de aproximativ 10-4-10-6 torr şi chiar mai mult.
Sistemul de vidare conţine una sau două pompe rotative care asigură un vid preliminar şi una de difuzie care ridică vidul la cotele cerute de rezoluţia microscopului. Totodată, sistemul conţine o serie de supape manuale şi automate cu rol de protecţie în timpul utilizării instrumentului.
1.2.2. Microscopul electronic cu voltaj înalt (HVEM)
Microscop de transmisie ce foloseşte o tensiune mai mare de 300.000 V, ajungând, la unele tipuri, până la 3-5 MeV.
Primul microscop electronic cu o tensiune de accelerare de 1 milion de volţi (1 MV) a fost construit în 1960 de către Dupony şi Perrier în laboratorul de optică electronică din Toulouse, această realizare constituind punctul de plecare pentru o nouă generaţie de microscoape electronice.
În ciuda complexităţii lor şi a costului ridicat ele s-au dovedit extrem de utile, deoarece într-un astfel de microscop electronii pot trece prin preparate care au grosimi de 14 µm, fiind posibil ca secţiuni de grosimea celor realizate de un microtom obişnuit să fie uşor examinate, uneori fără a mai fi colorate. De asemenea se pot cerceta celule întregi fără a fi incluzionate, iar Porter şi Fotino (1974) au demonstrat că în aceste condiţii se poate realiza mai uşor reconstituirea tridimensională a structurilor şi evidenţierea enzimelor.
Folosindu-se microscopul electronic Toulouse 3000 cu o tensiune de accelerare de 1 MV s-au obţinut fotografii ale unor bacterii, ale moleculelor de acizi nucleici. De asemenea, utilizându-se un alt tip de microscop electronic cu voltaj înalt JEM 1000 D, s-a reuşit urmărirea evoluţiei cromozomilor în meioză. Rezultatele obţinute până în prezent în cercetarea biologică arată că microscopia de voltaj înalt va avea mari perspective în viitor.
Acest tip de microscop se bazează pe acelaşi principiu constructiv ca şi la microscoapele convenţionale de 100 kV. Înalta tensiune utilizată presupune însă realizarea unei coloane cu mult mai înaltă, iar înlăturarea vibraţiilor din coloană necesită şi realizarea unei fundaţii cu mult mai stabilă decât în mod obişnuit.
Astfel, întreg ansamblul poate atinge înălţimea unei clădiri pe trei nivele. La fel, lentilele sunt mai puternice iar curentul absorbit de ele şi de sistemul de accelerare a fluxului conduc la utilizarea unor blocuri de alimentare electrică mai perfecţionate şi mai costisitoare. Sunt necesare de asemenea, măsuri de securitate sporite pentru evitarea iradierii personalului.
1.2.3. Microscopul electronic analitic de transmisie (TEAM)
TEAM este format dintr-un microscop electronic de transmisie de înaltă rezoluţie, la care se ataşează un microanalizor de raze X din clasa spectrometrelor.
Noutatea adusă de TEAM constă în posibilitatea de a culege şi informaţii cu privire la elementele chimice cuprinse în preparat, pe lângă cele de ordin morfo-structural, prin difracţie de electroni conţinute de CTEM.
Funcţionează pe baza analizei lungimii de undă dispersate, sau mai nou pe baza analizei energiei dispersate. Astfel, bombardarea printr-un fascicul de electroni a unor preparate determină emisia de radiaţii X a căror lungime de undă este caracteristică atomilor bombardaţi; spectrometrul măsoară aceste lungimi de undă, permiţând determinarea compoziţiei chimice elementare a unor volume extrem de mici de materie.
Până în prezent s-au conturat câteva direcţii de cercetare, prin utilizarea TEAM, cum ar fi: i. localizarea elementelor chimice existente în condiţii normale în ţesuturi, în special a ionilor de Na+ şi Ka+; ii. detectarea unor elemente în anumite stări patologice cum ar fi de exemplu: intoxicaţiile sau carenţele fiziologice; iii. aprecierea distribuţiei unor elemente poluante în diferite verigi ale lanţului biologic; iv. identificarea unor reacţii chimice între diferite elemente pe baza analizării unor precipitate ce se formează în ţesuturi.
1.2.4. Microscopul electronic de baleiaj (SEM)
SEM spre deosebire de TEM furnizează imagini tridimensionale ale suprafeţelor probelor cercetate, ale căror dimensiuni sunt de ordinul centimetrilor, dar nu pot furniza informaţiile morfo-structurale ce se regăsesc în grosimea materialului.
Formarea imaginii se bazează pe principiul emisiei electronilor secundari, reflectaţi în urma bombardării probei de către fasciculul primar de radiaţii X.
Fasciculul de electroni cade sub un anumit unghi pe probă producând reflexii sub unghiuri diferite în funcţie de incidenţa particulei cu zona de impact. Spotul de radiaţii baleiază în timp întreaga suprafaţă a probei, astfel încât pe ecran apare imaginea, la scară dorită, a zonei scanate.
Constructiv, SEM are în plus un detector al electronilor secundari emişi în urma interacţiunii cu suprafaţa probei. Curentul produs de acesta este modulat şi trimis în final spre blocul de baleiere al unui tub cinescopic dintr-un monitor.
Pregătirea probei pentru analiza cu un astfel de microscop este mai uşoară, nefiind necesare realizarea de secţiuni ultrafine. Pe de altă parte, rezoluţia este mai mică cam de 10 ori faţă de TEM.
Condiţia principală impusă probelor examinate printr-o astfel de metodă este ca suprafaţa acestora să fie conductoare pentru evitarea acumulării de sarcini electrice pe suprafaţă. În cazul unei analize calitative, probele sunt tăiate şi polizate mecanic sau chimic. În cazul unei probe la care se impune studiul morfostructural de suprafaţă sau al compoziţiei, suprafaţa probei trebuie pregătită în prealabil. Totodată, probele neconductoare se acoperă cu un strat fin de ordinul Å grosime, depus prin evaporare în vid, stratul realizând astfel neutralitatea electrică a suprafeţei impusă de condiţiile specifice de lucru în microscopia de baleiaj.
Pentru obţinerea unei depuneri uniforme a stratului în cazul probelor a căror suprafaţă este rugoasă, acestea sunt supuse rotirii sub anumite unghiuri în tot timpul depunerii. Stratul depus este o vopsea pe bază de argint coloidal, observarea fiind ameliorată prin depunerea de straturi succesive de Au şi Pd, grosimea totală nedepăşind 1000 de Å.
În cazul probelor biologice care conţin apă şi lichide volatile şi care sunt supuse evaporării în timpul baleierii datorită vidului existent în coloană, este necesară, în prealabil, ca şi în microscopia de transmisie, deshidratarea şi eventual îngheţarea lor, înlăturând, astfel, efectele nedorite.
LUCRARE PRACTICA 7 Prepararea ţesuturilor pentru observarea la microscopul electronic
Pregătirea ţesuturilor pentru observarea la microscopul electronic trebuie să parcurgă aproximativ aceleaşi etape de lucru ca şi cele din microscopia optică, dar, toate prelucrările se execută în condiţii mult mai strict controlate şi exacte. Dificultatea mare a acestor metode rezultă în primul rând din faptul că pentru microscopia electronică de tip TEM, grosimea secţiunilor trebuie să nu depăşească 800-1000 Å. De asemenea, prelucrarea probelor se efectuează cu mare precauţie şi în condiţii care să evite pe cât pe posibil apariţia artefactelor. 1. Recoltarea probelor a. Pentru a preveni schimbările de orice natură care pot apărea la nivel celular chiar din momentul recoltării probelor este necesar întotdeauna să se ia în consideraţie particularităţile tipului de organism, organ sau ţesut. Modalităţile de recoltare diferă dacă dorim să preparăm o suspensie de celule sau un ţesut. O condiţie esenţială este ca proba să fie recoltată numai prin biopsie, de la un organism viu. Chiar şi în acest caz, condiţiile de recoltare trebuie să se facă uneori în condiţii stricte. b. Majoritatea specialiştilor recomandă ca ţesutul să fie în prealabil prefixat. Aceasta presupune ca soluţia fixatoare să fie aplicată pe suprafaţa organului prin perfuzia acestuia cu fixator. În acest fel agentul de fixare introdus direct în circulaţie, asigură o conservare rapidă şi omogenă a întregului ţesut. Probele de ţesut se taie de obicei cu lame de ras degresate. c. Nu se recomandă folosirea unui foarfece deoarece acesta striveşte celulele de pe suprafaţa tăiată. Fragmentul de ţesut se depunde pe o hârtie de filtru umectată cu fixator şi se fragmentează în piese de maximum 1 mm3. Datorită volumului extrem de mic al piesei, este foarte importantă zona din care se recoltează. 2. Fixarea cu Glutaraldehidă a. Are ca scop realizarea unor legături chimice transversale între lanţurile polipeptidice a două molecule proteice vecine. Fixarea se face timp de 90 min., la 4°C, la întuneric, cu o soluţie fixator de glutaraldehidă 2% în tampon cacodilat 0,2 M. b. Prepararea tamponului cacodilat 0,2 M (1) Soluţii stoc: (a) Soluţia A: Cacodilat de sodiu 0,2 M cacodilat de sodiu Na(CH3)2AsO4 x 3 H2O ….. 4,28 g apă bidistilată ….. ad. 100 ml (b) Soluţia B: HCl 0,2 M HCl concentrat (36-38%) …. 10 ml apă bidistilată ….. 603 ml (2) Soluţia de lucru pH 7,4: (a) Soluţie A ….. 50 ml (b) Soluţie B …. 2,7 ml (c) apă bidistilată ..... ad. 200 ml - în cazul în care pH-ul nu este exact 7,4 se ajustează cu Soluţie B înainte ca sa se fi adus la volumul final. c. Prepararea fixatorului de glutaraldehidă 2% a. Soluţie stoc de glutaraldehidă 25% ….. 8 ml b. Soluţie tampon cacodilat de lucru, pH 7,4 …. 92 ml 3. Spălare cu tampon cacodilat pH 7,4. De trei ori câte 5 minute, la 4°C şi la întuneric. 4. Postfixarea cu tetraoxid de osmiu (OsO4). Pe lângă faptul că reacţionează cu unii dintre aminoacizii proteinelor tisulare, tetraoxidul de osmiu stabileşte legături transversale între lanţurile nesaturate ale unor acizi graşi din moleculele lipidice. Postfixarea se face cu o soluţie de OsO4 1%, timp de 90 min., la 4°C şi la întuneric. Atenţie! OsO4 este o substanţă foarte toxică. a. Prepararea 0sO4 4% (soluţiastoc). O fiolă care conţine 1 g de tetraoxid de osmiu se spală foarte bine cu detergent, apoi cu amestec sulfocromic, apă de robinet şi în cele din urmă cu apă bidistilată (fiola se manevrează cu penseta). Se introduce fiola spălată într-un flacon cu pereţii groşi, în care se află 25 ml de apă bidistilată. Flaconul se închide cu un dop ermetic şi prin agitare puternică se sparge fiola. Se lasă până a doua zi la 4°C. se păstrează la 4°C, ferit de lumină, perfect închis. b. Prepararea OsO4 1% (soluţia de lucru) (1) Os04 4% …. 2,5 ml (2) Tampon cacodilat pH 7,4 (soluţia de lucru) ….. 7,5 ml Atenţie! Nu se pipetează cu gura! 5. Clătire cu apă bidistilată. De trei ori câte 5 min, la temperatura camerei. 6. Contrastare în bloc cu acetat de uranil. Timp de 30 minute, la 4°C, la întuneric. a. Prepararea acetatului de uranil (1) Acetat de uranil …. 1 g (2) Alcool etilic 10% …. 50 ml Se agită energic până ce soluţia devine clară. 7. Spălare cu alcool 10%. De 2 ori, câte 3 minute, la temperatura camerei. 8. Deshidratare cu alcool etilic 70%. Timp de 5 minute la temperatura camerei. 9. Deshidratare cu alcool etilic 90%. Timp de 5 minute la temperatura camerei. 10. Deshidratare cu alcool etilic absolut. De 3 ori câte 5 minute, la temperatura camerei. 11. Deshidratare cu propilen oxid. De 2 ori câte 15 min, la temperatura camerei. 12. Penetrare cu Epon 812. Această etapă are rolul de a asigura impregnarea probelor cu Epon (răşina de includere). Acest proces nu se poate face decât dacă Eponul este dizolvat în propilen oxid. În etapa următoare, propilen oxidul se evaporă (este extrem de volatil), în ţesut rămânând doar răşina. Se face cu un amestec Epon includere: propilen oxid (1:1), cei puţin 1 oră, dar poate fi lăsat şi peste noapte. a. Prepararea Epon includere (1) Epon A: Epon 812 …. 20 ml DDSA …. 32 ml Se amestecă bine cu o baghetă. Se păstrează timp de 6 luni în sticle bine închise, la 4°C. (2) Epon B: Epon 812 …. 32 ml MNA …. 28 ml Se amestecă bine cu o baghetă. Se păstrează timp de 6 luni în sticle bine închise, la 4°C. (3) Epon includere: Se prepară după încălzirea la temperatura camerei a stocurilor. În funcţie de raportul dintre stocuri se poate determina duritatea blocurilor după cum arată Tabelul 1-4. 13. Evaporarea propilen oxidului. Se face în flacoane deschise, fixate pe un aparat rotator, cel puţin 8 ore. 14. Penetrarea cu Epon de includere. Se face prin introducerea fragmentelor de ţesut într-un volum de cel puţin 5 ori mai mare de Epon de includere. Timp: 2 ore, prin rotire continuă, dar foarte lentă, 1-2 rpm. 15. Includerea. Se efectuează în capsule de plastic speciale sau plăcuţe speciale din material cauciucat flexibil. Cu o spatulă se ia un fragment de ţesut şi se introduce în vârful capsulei, unde s-a pus în prealabil o mică picătură de Epon de includere. În această fază se poate realiza orientarea probei. Se toarnă apoi în capsulă restul de Epon de includere până se umple capsula, se pune căpăcelul şi se introduc capsulele la termostat la 60-70°C pentru a se produce polimerizarea. Pentru producerea unei polimerizări complete, capsulele se ţin la această temperatură timp de 72 ore.
| | | |Tabelul 1-4 |
|Raportul dintre soluţiile stoc de Epon pentru determinarea durităţii blocurilor |
|Epon A |Epon B |Catalizator DMP-30 |Calitatea blocurilor |
|(ml) |(ml) |(ml) | |
|7 |3 |0,15 |Moi |
|5 |5 |0,15 |Semidure |
|3 |7 |0,15 |Dure |
16. Secţionarea. Este una din cele mai dificile operaţiuni, deoarece grosimea secţiunilor nu trebuie să depaşească 800 Å. Pentru secţionare se foloseşte un aparat de o mare sensibilitate numit ultramicrotom. El funcţionează, în principal, după principiul microtomului obişnuit, însă mecanismul care asigură înaintarea preparatului este construit special pentru a asigura avansul extrem de fin, corespunzător grosimii secţiunilor. Deoarece secţiunile obţinute nu sunt vizibile cu ochiul liber, toate operaţiunile de secţionare se fac sub o lupă binocular care se află ataşată la ultramicrotom. Se înţelege deci că toate manevrele trebuie să se facă în condiţii de mare fineţe, care să evite vibraţiile, curenţii de aer, variaţiile mari de temperatură. a. Prepararea cuţitelor (1) Cuţitele cele mai des utilizate pentru ultramicrotomie sunt cuţitele de sticlă. Acestea se prepară în momentul folosirii, manual sau cu un aparat special. Pentru prepararea unui cuţit se foloseşte o bară de sticlă de calitate specială cu grosimea de 5-8 mm, lăţimea de 2-3 cm şi lungimea de 20-30 cm. (2) Înainte de a începe confecţionarea unui cuţit, bara trebuie curăţată foarte bine cu un tampon de vată înmuiat în acetonă. Pentru evitarea depunerilor de pete de grăsime pe suprafaţa sticlei se recomandă ca toate operaţiile să fie făcute cu mănuşi. Bara astfel curăţată se pune pe suprafaţa plană a unei foi de cauciuc şi apoi cu un cuţit de zgâriat sticlă (folosit în mod curent pentru lăsat sticla), sa zgârie o linie care să delimiteze la una din extremităţile barei un pătrat. Introducând sub această linie un băţ de chibrit şi apoi apăsând, se rupe din bară un pătrat de sticlă. Din acest fragment se vor putea confecţiona două cuţite. Pentru aceasta se zgârie din nou sticla pe diagonala pătratului. Aceasta se face însă în aşa fel încât la cele două muchii, să rămână câte un mm nezgâriat. (3) Introducând din nou un chibrit sub această linie şi apăsând cu atenţie şi uniform sticla se va rupe în două triunghiuri, dar în apropierea muchiilor nezgâriate, sticla, nu se rupe, ci se sparge. Acestea vor fi muchiile de tăiere, a căror lamă este extraordinar de fină. Cuţitele astfel preparate se pot păstra ferite de praf, în cutii speciale, cel mult 2-3 zile, interval în care trebuiesc folosite pentru secţionare, altfel lama lor de tăiere se strică de la sine. Se va avea grijă, de asemenea, ca această lamă să nu vină în contact cu nici un fel de material. Calitatea lamei de tăiere a cuţitului confecţionat se verifică la lupa binocular a ultramicrotomului. (4) Secţiunile realizate cu un asemenea cuţit vor fi colectate pe suprafaţa apei dispusă într-o băiţă confecţionată în spatele lamei de tăiere cu ajutorul unei benzi, adezive. În timpul secţionării, secţiunile plutesc pe suprafaţa apei şi pot fi, văzute la microscopul stereoscopic. b. Fasonarea blocurilor. Blocurile cu ţesutul inclus, nu se pot folosi pentru secţionare ca atare, deoarece, secţiunile fiind foarte fine, suprafaţa de secţionare trebuie să fie foarte mică (cu latura de 0,3-0,5 mm). Pentru aceasta, blocul se fixează la ultramicrotom cu vârful în sus şi, privind în microscop, se fasonează cu ajutorul unei lame de ras zona care conţine ţesutul pentru a se obţine o piramidă a cărei bază mică (de la extremitatea superioară) să aibă forma unui trapez. Această suprafaţă va constitui suprafaţa de secţionare. c. Secţionarea se face în condiţii strict controlate. De obicei, ultramicrotomul trebuie instalat într-o cameră specială în care efectul vibraţiilor, care pot deranja foarte mult procesul de secţionare, trebuie sa fie eliminat, pe cât posibil, în totalitate. Reglarea aparatului se face relativ uşor, acesta fiind prevăzut cu sisteme de reglaj corespunzătoare. (1) La început, secţionarea se face manual, pentru intrarea în bloc, iar apoi aparatul se reglează în aşa fel încât să realizeze secţiuni de grosime corespunzătoare. Grosimea secţiunilor se apreciază după culoarea lor dată de irizaţiile realizate de lampa cu care este echipat stereomicroscopul. Secţiunile care au grosimea corespunzătoare au culoarea argintie-cenuşie, iar cele aurii sunt de grosimea maximă care mai permite observarea la microscop. (2) O secţionare corectă are ca rezultat obţinerea unei benzi de secţiuni de aceeaşi culoare. Celelalte secţiuni, se îndepărtează prin deplasarea lor la marginea băiţei cu ajutorul unui fir de păr de geană lipit de vârful unei scobitori în aşa fel încât bulbul să fie liber. Orice alt material este impropriu, deoarece secţiunile aderă la acesta şi sunt practic pierdute. 17. Dispunerea secţiunilor pe grilă. Suportul pentru preparat în microscopia electronică nu este lama de sticlă, ci unul special, care se numeşte grilă. Grila este un disc de cupru cu diametrul de 2,5-3 mm, prevăzut cu o reţea cu ochiuri de dimensiuni microscopice. Mărimea ochiurilor este variabilă în funcţie de tipul de grilă. Pentru ca grilele să constituie un suport bun pentru preparat, acestea se acoperă cu pelicule organice sau anorganice foarte fine, transparente la fasciculul de electroni, a căror grosime nu trebuie să depăşeasă 200 Å. Aceste pelicule se confecţionează după diverse metode, iar cea mai utilizată este pelicula organică de formvar. După acoperirea grilelor cu peliculă acestea se tratează pe suprafaţă cu vapori, de carbon, prin depunerea cărora pelicula dobândeşte o rezistenţă mare la bombardamentul cu electroni ceea ce permite examinarea preparatului, la puteri mari de mărire. Depunerea secţiunilor pe grile se face destul de simplu, prin aplicarea grilei prinsă într-o pensetă fină, pe suprafaţa băiţei de apă pe care plutesc secţiunile. Toată această operaţie se face privind în stereomicroscopul ultramicrotomului. Prin atingere de pelicula grilei, secţiunile aderă foarte bine la aceasta, iar după uscare, grilele pot fi observate la microscop.
Evidenţierea unei suspensii de liposomi la microscopul electronic, prin contrastare negativă. Contrastarea negativă este o tehnică foarte simplă de evidenţiere la microscopul electronic a conturului unor particule aflate în suspensie. Prin această tehnica se pot observa suspensii de virusuri, bacterii, organite celulare izolate etc. În cele ce urmează vom prezenta o metodă simplă de contrastare a unor particule materiale artificiale, reprezentate de liposomi. Liposomii sunt vezicule fosfolipidice artificiale care se pot prepara prin dispersia fosfolipidelor în soluţii apoase. Datorită caracterului amfifil al moleculelor fosfolipidice, acestea, dispersate în apă, se vor dispune în aşa fel încât capătul hidrofob al moleculei lor să nu vină în contact cu apa. De aceea, ele vor forma bistraturi fosfolipidice cu structura identică cu a membranelor celulare naturale. De aceea liposomii sunt modele artificiale de membrană. Bistraturile fosfolipidice care se agregă la prepararea liposomilor se dispun în structuri veziculare, conţinând în interior un compartiment apos. Aceste vezicule, cu dimensiuni de câteva sute de nm, pot fi observate toarte bine la microscopul electronic prin contrastare negativă cu acid fosfotungstic. 1. Prepararea liposomilor. Se dizolvă în 2 ml de cloroform: lecitină de ou (sau orice alt fosfolipid), 25 mg şi colesterol, 2,5 mg. Soluţia organică de cloroform cu lipide se introduce într-o eprubetă cu fundul mai larg şi se evaporă cloroformul la rotavaporizator, la 37°C, astfel încât să se formeze pe pereţii flaconului o peliculă subţire de lipide. Peste această peliculă se adaugă 2 ml de soluţie fiziologică (tampon fosfat salin) şi se agită energic cu mâna, sau cel mai bine cu un agitator vortex, până la desprinderea lipidelor de pe pereţii flaconului şi formarea unei suspensii omogene lăptoase. Această suspensie conţine liposomi multilamelari relativ mari, Ia care membranele sunt dispuse concentric ca foiţele de ceapă. Suspensia de liposomi multilamelari se supune acţiunii ultrasunetelor, la un aparat generator de ultrasunete, până ce devine clară. Se obţine astfel o suspensie omogenă de liposomi oligolamelari şi unilamelari foarte mici, pe care o vom utiliza pentru observarea la microsopul electronic. 2. Contrastarea. Contrastarea constă din depunerea particulelor de examinat, transparente la electroni, pe un mediu reprezentat de un constrastant electrono-opac (săruri de metale grele), şi apoi observarea la microscopul electronic. a. Prepararea agentului contrastant: Acid fosfotungstic, 1 g, Tampon fosfat salin, ad. 100 ml. b. Pe o placă acoperită cu parafilm se pune o picătură de liposomi, peste care se adaugă încă o picătură de acid fosfotungstic şi se amestecă picăturile cu vârful unei pipete Pasteur. După 20 de secunde se pune pe suprafaţa picăturii o grilă acoperită cu peliculă de formvar, cu suprafaţa peliculei în jos, în contact cu lichidul. După 30 de secunde de contact, se ridică grila cu o pensetă şi se absoarbe excesul de lichid care a rămas pe grilă cu o hârtie de filtru tăiată în vârf ascuţit prin atingerea acesteia de marginea grilei. După uscare, se poate observa la microscop.
3. Rezultate. Pe un fond întunecat, liposomii multilamelari sau oligolamelari au aspectul unor formaţiuni membranare concentrice, dispuse alternativ, o lamelă electrono-transparentă, o lamela electrono-opacă etc. (ca foiţele de ceapă). Liposomii unilamelari apar ca vezicule electrono-transparente pe un fond opac.
Anumite celule, cum ar fi celulele epiteliale, dezvoltă modificări ale suprafeţei celulare pentru a le facilita funcţiile. Aceste modificări pot lua forma unor extensii stabile (microvili, stereocili, cili şi flageli), pliuri şi interdigitaţii, cât şi joncţiuni intercelulare specializate. 1. Microvilii (Fig. II-13) sunt extensii „în deget de mănuşă” la suprafaţa celulelor epiteliale ceea ce le creşte suprafaţa de absorbţie. a. Morfologia în microscopia optică. Un singur microvil nu este vizibil în microscopia optică, dar o aglomerare de microvili poate fi observată la suprafaţa celulei ca nişte fine striaţii paralele cu axul lung al celulei. Striaţiile au fost denumite platou striat. b. Morfologia în microscopia electronică. Microvili individuali sunt identificaţi ca fiind extensii tubulare ale membranei plasmatice la polul apical al celulelor epiteliale. (1) Microvilii au un diametru relativ constant de aproximativ 0,1 μm. Lungimea lor poate varia (1-3 μm) dar este aproape constantă pentru acelaşi tip de celule. (2) Microvilii au un centru de filamente de actină cu rol de suport ce confera rigiditate microvililor si contribui la menţinerea aranjamentului lor paralel. (a) Miezul de actină este ancorat la membrana plasmatică la polul apical şi lateral al microvililor. Miezul se extinde în citoplasma apicală, unde interacţionează cu o reţea terminală, orizontală de actină. (b) Contracţiile reţelei terminale pot determina creşterea spaţiului dintre microvili prin depărtarea vârfurilor acestora. c. Enzimele microvilare. Numeroase enzime digestive sunt inserate în membrana plasmatică a microvililor şi au roluri specifice în digestie şi absorbţie. 2. Stereocilii. Stereocilii sunt microvili elongaţi ce nu prezintă motilitate şi nu au asemănări cu cilii, în pofida numelui lor. La fel ca şi microvilii, aceştia conţin filamente de actină în centru. a. În sistemul reproducător masculin, stereocilii pot fi observaţi pe secţiuni tisulare, proiectându-se în lumenul epididimului şi a vaselor deferente, sub formă de piramide. Funcţia lor este de absorbţia substanţelor din lumen. b. În urechea internă, stereocilii pot fi observaţi la nivelul celulelor păroase ale organului Corti şi canalelor semicirculare. Aici, stereocilii acţionează ca şi transductori, generând potenţiale electrice datorită forţelor mecanice ce acţionează asupra acestora prin percepţia sunetului sau mişcarea corpului. 3. Cilii şi flagelii. Cilii şi flagelii sunt structuri mobile ce sunt proiectate de pe suprafaţa unei celule. Ei îşi au originea în corpii bazali. Cilii şi flagelii au elemente structurale similare, mecanisme de motilitate şi origini asemănătoare. Cilii şi flagelii pot mişca fluide şi particule de-a lungul suprafeţei celulare sau pot contribui la mişcarea celulară. a. Morfologia în microscopia optică (1) Cu microscopul optic, cilii apar ca şi multiple structuri scurte asemănătoare firului de păr ce se proiectează de la suprafaţa unei celule. Flagelii sunt mai lungi decât cilii şi de obicei celulele au doar un singur flagel. (2) Când cilii sunt prezenţi în număr mare (ex. epiteliul traheal), corpii lor bazali sunt vizibili ca şi o bandă de culoare închisă, în citoplasmă, imediat sub cili. b. Morfologia în microscopia electronică. Cilii şi flagelii sunt compuşi dintr-un „buchet” de microtubuli (Figura II-14, II-15) (1) Axonema, sau miezul unui cil sau flagel este constituit din 9 dublete concentrice de microtubuli în jurul unei singure perechi de microtubuli (Figura 15). (2) Din fiecare dublet se extind în inelul extern braţele dineinei ce conferă cililor şi flagelilor motilitatea acestora. c. Motilitatea cililor şi flagelilor (1) Prin hidroliza ATP se produce o forţă de mişcare a braţelor dineinei, ceea ce permite alunecarea dubletelor adiacente de microtubuli. Această alunecare stă la baza motilităţii cililor şi flagelilor. (2) Cilii realizează o mişcare „de biciuire”, în timp ce flagelii realizează o mişcare „de unduire”. (3) Multitudinea de cili de pe suprafaţa epitelială realizează o bătaie rapidă (până la 15 bătăi pe secundă) în mod sincronizat. O bătaie ciliară prezintă o mişcare iniţială puternică, rapidă şi o mişcare de revenire lentă. (a) În mişcarea iniţială, toţi cilii dintr-o anumită regiune a epiteliului se mişcă într-o singură direcţie, complet extinşi, „măturând” fluidele şi suspensiile. (b) Mişcarea de revenire determină revenirea cililor în poziţia iniţială cu o mişcare de circulară, reducând astfel coeficientul de vâscozitate. (4) Spre deosebire de cili, flagelii se mişcă printr-o serie de undulaţii ce se propagă de la bază până la vârful flagelului. 3. Pliuri şi interdigitaţii. Suprafeţele laterale şi bazale ale unor celule epiteliale prezintă amplificaţii extinse ale membranei plasmatice (Figura II-16). Aceste pliuri cresc suprafaţa celulară şi crează un spaţiu intercelular complex. Pe lateral, amplificaţiile sunt intersectate sau prezintă interdigitaţii cu proiecţiile laterale corespondente ale celulelor adiacente. a. Pliuri interne bazale şi striaţiile. În unele celule, procesele bazale conţin mitocondrii ale căror ax lung este paralel cu axul lung al celulei. Această orientare produce striaţiile bazale ce pot fi observate în secţiunile tubulilor renali şi ale ductelor unor glande salivare. b. Transportul fluidic transepitelial. În epiteliul absorbant, suprafeţele membranare laterale sunt bogate în Na+, K+-ATPază. (1) Na+ este pompat din citoplasmă de-a lungul membranei laterale astfel că spaţiul dintre interdigitaţiile laterale devine hipertonic. Apa ce însoţeşte Na+-ul destinde spaţiul potenţial dând naştere spaţiului intercelular datorită unei presiuni hidrostatice crescute. Această presiune conduce fluidul din acest spaţiu în ţesutul conjunctiv adiacent. (2) Mitocondriile asociate cu membrana plasmatică laterală asigură sursa energetică necesară acestui proces.
8
Preparate de examinat: intestin subtire (microvili), epiteliu respirator – bronhii (cili), testicul (flageli)
|[pic] |
|Fig. II-13 Glicocalixul şi microvilii în microscopia electronică |
|[pic] |
|Fig. II-14 Imagine de electronomicroscopie a cililor |
|în secţiune longitudinală |
|[pic] |
|Fig. II-15 Axonema cililor în secţiune transversală |
|[pic] |
|Fig. II-16 Pliuri şi interdigitaţii ale celulelor epiteliale |
Lucrarea nr. 9 Morfologia celulară
Forma celulelor
I. Celule cu formă schimbătoare: neutrofilele, monocitele sînt celule sferice care circulă în sînge o perioadă de timp şi într-o etapă ulterioară migrează în ţesuturi unde se maturează şi devin macrofage ( celule cu prelungiri). Ele sînt prezente în majoritatea organelor, iar totalitatea lor în organism constituie sistemul de apărare fagocitar macrofagic-mononuclear. Macrofagele au denumiri diferite, în diferitele organe şi ţesuturi unde s-au stabilit, astfel: ▪ histiocite în ţesutul conjunctiv ▪ celule Kupffer în ficat ▪ macrofage alveolare în plămîni ▪ macrofage pleurale şi peritoneale în cavităţile seroase ▪ celule microgliale în sistemul nervos central ▪ osteoclaste în ţesutul osos Macrofagul este o celulă relativ mare, cu diametrul de aprox. 30-60 microni, forma sa diferind în raport cu starea sa funcţională. Astfel, există o formă inactivă sau de repaus, care are suprafaţa neregulată, nucleul mic şi prelungiri de diferite mărimi şi forme. Forma activă sau fagocitară, celulele prezintă pseudopode orientate în toate direcţiile, acestea ajutînd atît la deplasare cît şi la fagocitare de particule străine.
II. Celule cu formă fixă
1. Celule sferice Ex: celulele sangvine ovulul: secţiune prin ovar, coloraţie HE adipocitul: -ţesut conjunctiv adipos, HE -citoplasma este redusă şi dispusă sub formă de semilună la periferia celulei sub membrana celulară, ea fiind împinsă aici de picătura de grăsime care ocupă aproape toată celula; nucleul este turtit şi situat excentric în zona de citoplasmă periferică. Datorită acestui lucru adipocitul are aspect de „ inel cu pecete” 2. Celule cilindrice Ex: enterocitul- epiteliul simplu cilindric din intestin, HE - sînt celule înalte, cu nuclei ovoidali, în formă de bastonaş, dispuşi paralel cu axul lung al celulei, în treimea inferioară - la polul apical enterocitele sînt prevăzute cu numeroşi microvili, care le măresc suprafaţa de absorbţie, formînd platoul striate. 3. Celule cubice Ex: tireocitele ( celulele foliculare tiroidiene) -sînt celule izodiametrice, de formă cubică, dispuse într-un singur rînd pe membrana bazală; nucleii sînt sferici - de regulă au formă cubică, dar ele devin cilindrice în hiperfuncţie şi turtite în hipofuncţie Celule pavimentoase Ex: celulele endoteliale care formează endoteliile vasculare celulele mezoteliale care tapetează seroasele 4. Celule alungite, fusiforme Ex: miocitul, fibra musculară netedă – ţesut muscular neted, secţ. long. HE (formează musculatura viscerală, constituindtunicile contractile ale organelor cavitare) - sînt celule alungite, cu capete ascuţite, grupate în fascicule; nucleul este unic, are formă de cilindru sau bastonaş, dispus central şi paralel cu axul lung al celulei fibra musculară striată – formează muşchi scheletici - sînt celule de formă cilindrică, cu extremităţile rotunjite, lungimea lor variază între 2-4 cm şi 12 cm ( muşchiul croitor) - nucleii sînt foarte numeroşi, cîteva sute într-o fibră de mărime medie; au formă ovalară sau alungită, cu axul lung paralel cu cel al fibrei şi sînt dispuşi pe două rînduri, alternativ
5. Celule cu prelungiri Ex: neuronul ( celula nervoasă ) şi celula glială ( nevroglia) - este o celulă polimorfă, constituită din corp celular ( pericarion) şi din două tipuri de prelungiri citoplasmatice: axonul şi dendritele - forma celulelor nervoase este dată de mărimea pericarionului şi de numărul prelungirilor a) neuron multipolar: este o celulă stelată cu numeroase prelungiri dendritice şi un axon ( ex. neuron multipolar din coarnele anterioare ale măduvei spinării) b) neuron piramidal: pericarionul are formă triunghiulară. Dendritele pornesc din vîrfurile triunghiului, iar axonul unic de la jumătatea uneia din laturi ( ex. neuroni piramidali din scoarţa cerebrală) c) neuron piriform: pericarionul are formă de pară, cu un axon unic şi o dendrită unică groasă, ce se arborizează bogat ( ex. neuron Purkinje din scoarţa cerebeloasă) d) neuron pseudounipolar: corp rotund din care se desprinde o prelungire iniţial unică şi după un scurt traiect se bifurcă într-o ramură periferică- dendritică- şi alta centrală-axonică, avînd forma literei T ( ex. neuroni pseudounipolari din ganglionul spinal)
LUCRARE PRACTICĂ 10
Metode de evidenţiere ale nucleului şi nucleolului. Evidenţierea acizilor nucleici prin tehnica citochimică Brachet
Nucleul este structura cea mai proeminentă pe un preparat microscopic a oricărei celule aflate în interfază. Este centrul activităţii celulare, depozitul acidului dezoxiribonucleic cromozomial (ADN), şi locul sintezei şi procesării acidului ribonucleic (ARN).
ÎNVELIŞUL NUCLEAR
ÎNVELIşUL NUCLEAR ESTE FORMAT DIN DOUă UNITăţI MEMBRANARE CE SERVESC CA şI LIMITă FIZICă ÎNTRE CITOPLASMă şI NUCLEU (FIG. V-6).
A. Membrana nucleară externă se află în contact cu citoplasma, este continuă cu reticulul endoplasmic rugos, şi este „împodobit” cu ribozomi şi poliribozomi.
B. Membrana nucleară internă se află în contact cu nucleoplasma şi este acoperită cu reţeaua laminei nucleare.
C. Spaţiul perinuclear este compartimentul dintre membranele nucleare interne şi externe. Este continuu cu spaţiul cisternelor rediculului endoplasmatic. 1. Proteinele sintetizate de polizomi legaţi de membrana nucleară externă sunt inseraţi în membrană sau sunt translocate de-a lungul membranei în spaţiul perinuclear. 2. Acele proteine ce nu rămân asociate de învelişul nuclear urmează aceeaşi cale ca şi proteinele sintetizate pe reticulul endoplasmatic rugos (vezi Capitolul 3 I B 2).
NUCLEOLUL
NUCLEOLUL (FIG. III-2, III-3, V-4, V-5) ESTE LOCUL TRANSCRIPţIEI ARN RIBOZOMAL (ARNR) şI AL ASAMBLăRII SUBUNITăţILOR RIBOZOMALE.
A. Morfologie. Nucleolul este o structură intranucleară nemembranară ce se colorează intens cu heatoxilină şi coloranţi bazici. 1. Nucleolul este prezent doar în nucleul interfazic. a. În mod obişnuit, fiecare celulă are doar unul sau doi nucleoli. Deoarece genele ce codifică ARNr sunt localizate pe 5 cromozomi diferiţi, există posibilitatea existenţei a mai mulţi nucleoli. De obicei, însă, aceştia fuzionează. 2. Prin microscopie electronică nucleolul apare ca o structură heterogenă cu regiuni fibrilare, granulare şi palid colorate.
B. Regiunile funcţionale. Sinteza de ARNr şi asamblarea subunităţilor ribozomale are loc în regiuni distincte ale nucleolului. Ulterior asamblării, subunităţile ribozomale mari şi mici imature suferă maturarea în timpul transferării lor în afara nucleului în citoplasmă prin complexele porului nuclear. 1. Regiunile fibrilare sunt situri ale transcripţiei active ale ARNr din genele ARNr (ARN ribozomal). 2. Regiunile granulare sunt situri de asamblare a ARNr, ARN 5S şi proteine ribozomale în subunităţile ribozomale. a. ARN 5S este transcris pe ADN în afara nucleolului. b. Proteinele ribozomale sunt sintetizate în citoplasmă pe polizomi liberi (vezi Capitolul 3 VII A) şi translocate în nucleu prin complexul porului nuclear. 3. Regiunile pal-colorate conţin ADN ce nu este transcris în mod activ.
PORII NUCLEARI
PORII REALIZEAZă CANALE PENTRU COMUNICAREA DIRECTă ÎNTRE NUCLEOPLASMă şI CITOPLASMă. MEMBRANELE INTERNE şI EXTERNE SUNT CONTINUI ÎN JURUL INELULUI PORULUI NUCLEAR (FIG. V-8).
A. Structura. Un por nuclear este cilindric în exterior, cu un diametru exterior de 120-140 nm şi un canal intern cu un diametru de 9 nm. Porul cilindric întinde distanţa dintre membranele nucleare interne şi externe. 1. Complexul porului nuclear este un ansamblu macromolecular cu o simetri octogonală. Fiecare por este compus din mai mult de 100 proteine globulare cu o masă moleculară totală estimată de 125 MD. 2. Învelişul nuclear a unei celule tipice de mamifer conţine între 3000 şi 4000 de pori nucleari. Acest număr este mai mare în celulele mai active transcripţional.
B. Funcţia. Una din cele mai importante funcţii ale complexului porului nuclear este aceea de transport selectiv al substanţelor prin învelişul nuclear. Transportul prin por este bidirecţional. Moleculele exportate din nucleu spre citoplasmă includ ARN de transfer (ARNt), subunităţile ribozomale şi ARNm. Moleculele importate din citoplasmă în nucleoplasmă includ ADN- şi ARN-polimeraze, proteine reglatoare, proteine ribozomale şi histone. 1. Difuziunea pasivă. Porii nucleari sunt permeabili pentru ioni şi molecule mici cu raza moleculara în jur de 4,5 nm (echivalentul a aproximativ 60 kD). Proteinele mai mari de 9 nm în diametru nu trec liber prin porul nuclear. 2. Transportul activ. Transportul moleculelor mari (> 9 nm în diametru) şi a complexelor macromoleculare prin complexul porului nuclear este un proces mediat de receptor ce necesită ATP. Pentru a tranzita complexul porului nuclear, proteinele trebuie să posede una sau mai multe secvenţe de localizare nucleară (NLS) în secvenţa lor primară de aminoacizi (Fig. V-9). a. NLS este o secvenţă peptidică scurtă de 4-8 aminoacizi de bază, încărcaţi pozitiv (ex. lizina, arginina, prolina). NLS poate fi localizat oriunde în proteină şi o proteină poate conţine una sau mai multe NLS. b. Mecanismul de transport (Fig. V-9) (1) Din citoplasmă în nucleu. Transportul proteinelor prin complexul porului nuclear este un proces în două etape. (a) Ataşarea. Proteinele ce posedă o NLS se leagă de proteine citosolice specifice pentru a forma un complex. Apoi complexul se ataşează de un receptor de la periferia complexului porului nuclear. (b) Translocarea (i) Proteina ce conţine NLS este transportată prin porul nuclear şi proteinele citosolice sunt eliberate înapoi în citoplasmă. (ii) Translocarea este un proces dependent de ATP. O parte a energiei obţinută prin hidroliza ATP este folosită în dilatarea tranzitorie a porului nuclear pentru a permite intrarea proteinelor transportate. (2) Din nucleu spre citoplasmă. Transportul ARN şi a subunităţilor ribozomale în afara nucleului spre citoplasmă este de asemenea un proces selectiv. De asemenea transportul în această direcţie pare să necesite un receptor. Detaliile mecanismului nu sunt pe deplin cunoscute.
LAMINA NUCLEARĂ
LAMINA NUCLEARă (FIG. V-11) ESTE O REţEA FIBROASă CE ALINIAZă SUPRAFAţA INTERNă A ÎNVELIşULUI NUCLEAR. LAMINA, CU O GROSIME DE 10-20 NM, DETERMINă STRUCTURA şI STABILITATEA NUCLEULUI INTERFAZIC şI MEDIAZă LEGAREA CROMATINEI DE ÎNVELIşUL NUCLEAR. ESTE ÎNTRERUPTă DE PORII NUCLEARI.
A. Compoziţie. Matricea nucleară este compusă din filamentele intermediare de tip IV denumite laminele nucleare A, B şi C (vezi Capitolul 4 IV A 3).
B. Rolul în mitoză. Lamina joacă un rol major în fragmentarea rapidă a învelişului nuclear la începutul mitozei şi în reasamblare la sfârşitul mitozei (vezi Capitolul 4 IV D 3).
MATRICEA NUCLEARĂ
ASPECTUL ORGANIZAT AL NUCLEULUI ESTE REZULTATUL EXISTENţEI UNEI SUBSTRUCTURI DENUMITE MATRICE NUCLEARă. ACEASTA ESTE O REţEA FIBROASă CE CONţINE APROXIMATIV 10% DIN TOTALUL PROTEINELOR NUCLEARE, 30% DIN ARN-UL NUCLEAR, 1-3% DIN ADN-UL TOTAL şI 3% DIN FOSFOLIPIDELE NUCLEARE.
A. Morfologia. Preparatele de matrice nucleară sunt obţinute prin dizolvarea învelişului nuclear, extrăgând ARN şi proteinele asociate şi prin digestia ADN-ului. 1. Vizualizate la microscopul electronic, astfel de preparate relevă o reţea fibroasă cu o formă similară cu nucleul. 2. În interiorul reţelei există elemente reziduale ale nucleolului, fibrile asociate cu complexe de pori nucleari şi fibrile asociate cu lamina nucleară.
B. Funcţia. Matricea nucleară se consideră a determina structura şi organizarea compartimentului nuclear intern. Aceasta serveşte ca şi o fază solidă la care sunt ataşate complexele enzimatice responsabile pentru transcripţia ARN şi replicarea ADN.
EVIDENŢIEREA ACIZILOR NUCLEICI PRIN COLORAŢIA BRACHET
Pe secţiuni histologice evidenţierea acizilor nucleici este posibilă prin utilizarea unor metode biochimice de culoare. Astfel, metoda Brachet, utilizînd coloraţia dublă cu verde de metil şi pironină pune în evidenţă structurile care conţin acizi nucleici. ADN-ul apare colorat în verde albastru prin verdele metil, iar ARN-ul apare colorat în roşu prin pironină. Ribozomii, conţinînd ARN, se găsesc fie liberi în citoplasmă, fie fixaţi pe reticulul endoplasmic, numărul lor determinînd bazofilia citoplasmei. De aceea unele celule cum sunt hepatocitele, celulele acinoase din pancreas şi glandele salivare (în zona lor bazală), apar cu citoplasma bazofilă. Preparatul examinat : secţiune prin ficat, colorare cu verde metil şi pironină. Hepatocitele prezintă citoplasma de culoare roz-roşie datorită ARN-ului ribozomal. Nucleul hepatocitelor, cînd apare pe secţiune, este colorat în albastru-verzui, datorită ADN-ului nuclear, şi conţine 1 sau 2 nucleoli intens coloraţi în roşu-violet (datorită ARN-ului nucleolar) Preparatul examinat : secţiune prin pancreas. În celulele acinoase nucleul este situat în treimea inferioară a celulei şi are o coloraţie albastră-verzuie (datorită ADN-ului nuclear). Conţine un nucleol colorat în roşu-violet (datorită ARN-ului nucleolar). Zona bazofilă a celulelor este intens colorată în roşu-violet datorită prezenţei în cantitate mare a ribozomilor (ce conţin ARN) în zona subnucleară şi perinucleară.
FORME NUCLEARE
Nucleul joacă un rol central în viaţa celulei, fiind partea cea mai specializată din celulă. Nucleul conţine genomul celulei, care constă dintr-un număr definit de molecule de ADN, fiecare din ele având structura caracteristică de dublu helix a ADN-ului. În plus nucleul conţine echipamentul necesar pentru repararea genomului , pentru replicarea sa, pentru transcrierea sa şi pentru prelucrarea ARN-ului. Forma şi mărimea nucleului diferă în funcţie de morfologia celulei. Poate fi sferic în celulele cubice sau poliedrice, alungit în celulele fusiforme, discoidal în celulele pavimentoase etc. Forma este legată de activitatea celulară.
1. Nucleu excentric. Adipocite. Hipoderm. Piele. Coloraţie HE. Pe o secţiune efectuată la nivelul pielii se identifică cele trei straturi (epiderm, derm şi hipoderm), foliculi pilari, glande sebacee, etc. În hipoderm se găsesc grupuri de celule adipoase, încărcate cu lipide care ocupă aproape toată citoplasma. Celulele au formă sferică, citoplasmă necolorată (lipidele nu se colorează). Lipidele intracitoplasmatice împing nucleul la periferie, turtind-ul, adipocitul căpătând astfel aspectul de „ inel cu pecete”.
2. Sânge periferic. Coloraţie MGG. - Granulocite neutrofile (nucleu segmentat) Pe un frotiu recoltat din sângele periferic se observă predominanţa celulelor anucleate, respectiv a hematiilor. Din loc în loc se găsesc şi elemente nucleate. Leucocitele neutrofile (granulocitele neutrofile) sunt cele mai numeroase leucocite, fiind prezente în sânge în procent de 45-75%. Sunt celule globuloase, emit pseudopode ceea ce le conferă o mare mobilitate. Durata de viaţă a neutrofilelor este de 2-5 zile, ele persistând în sânge 6-12 ore. Au nucleu caracteristic, segmentat, prezentând 2-5 lobi nucleari legaţi între ei prin punţi de cromatină. Aşezarea lobilor în neutrofil realizează forme diferite, asemănătoare literelor din alfabet (C, E, U, V, S, Z, Y). La sexul feminin aproximativ 3% din neutrofile prezintă la unul din lobii nucleari corpusculul Barr, ce reprezintă cromatina sexuală condensată a unuia din cei doi cromozomi X. Corpusculul sexual apare la microscop ca o prelungire a lobului nuclear sub forma unui băţ de tobă. Citoplasma neutrofilului este slab acidofilă, colorată în roz palid. Gradul de segmentare al nucleului corespunde cu vârsta celulei. În citoplasmă se găsesc numeroase granulaţii fine. - Limfocite (nucleu sferic) Limfocitul este o celulă sferică sau uşor ovală, se găseşte în sânge în proporţie de 25-45%. Nucleul limfocitului este mare,uşor incizat, colorat în violet, ocupând mare parte din citoplasmă care este redusă la un inel perinuclear. Citoplasma este bazofilă, conţine granulaţii azurofile, organite celulare. Durata de viaţă în sângele periferic este diferită, fiind situată între câteva zile şi un an, dar unele limfocite pot atinge şi vârsta de 5-25 ani. Limfocitele joacă un rol important în imunitate (limfocitele B şi T) - Granulocite eozinofile (nucleu bilobat) Eozinofilul se găseşte în sângele periferic în proporţie de 1-5%, fiind printre cele mai mari elemente din grupul granulocitelor segmentate. Celulele sunt sferice, cu nucleu bilobat sau „în desagă”. Se pot întâlni în sângele circulant şi eozinofile cu nucleu trilobat. Citoplasma este intens acidofilă, conţine organite celulare şi granulaţii acidofile. Durata de viaţă a eozinofilelor este de 8-12 zile. - Monocite (nucleu reniform) Monocitele se găsesc în sângele periferic în proporţie de 6-8%. Se împart în monocite mici-inactive şi monocite mari-active. Sunt celule globuloase, cu citoplasmă abundentă, bazofilă, ce se colorează în albastru-cenuşiu. Nucleul celulei este nesegmentat, mare, deseori reniform. Monocitul împreună cu macrofagul tisular joacă un rol important în apărarea organismului. Durata de viaţă în sângele circulant este de 10-60 ore.
3. Nucleu poliploid. Megacariocite (Măduva hematogenă), Miocite striate. Coloraţie MGG, HE Pe un frotiu recoltat de la nivelul măduvei hematogene se observă predominanţa elementelor nucleate, printre care găsim şi megacariocite. Sunt celule mari, rotund-ovalare, cu un diametru de 40-150μm. Nucleul este neregulat, lobulat, cu aspect „înmugurit”, colorat violet. Citoplasma este slab bazofilă, emite prelungiri, ceea ce îi conferă un aspect ameboidal. Megacariocitul prezintă fenomenul de endopoliploidie, ce reprezintă o diviziune celulară specială în cadrul căreia celula îşi dublează cantitatea de ADN la fiecare ciclu celular (2n, 4n,8n, 16n, 32n)
4. Modificări nucleare în transformări maligne. Celule neoplazice. Coloraţie HF. Pe o secţiune efectuată la nivelul unei tumori maligne se identifică grupuri de celule neoplazice de diferite mărimi şi forme care prezintă următoarele modificări: 1. inversarea raportului nucleu/citoplasmă (normal1) 2. nuclei pleomorfi, monstruoşi, ce ocupă aproape toată citoplasma, inegali ca formă şi mărime, cu cromatină nucleară laxă 3. nuclei denudaţi, membrana nucleară este incizată, margini neregulate, crenelate, citoplasmă redusă 4. mitoze atipice 5. nucleoli modificaţi ca formă şi mărime
De desenat: pericarion neuron multipolar, adipocite, cel. musculare striate, megacariocit (MRH), structura nucleului in ME
LUCRARE PRACTICA 11
Examinarea în imersie 1. Partea cea mai importantă a unui microscop este obiectivul, fiindcă de calităţile lui depind calităţile imaginii. a. Obiectivul este format din mai multe lentile montate într-un tub metalic. (1) Lentila inferioară este plan convexă, cu faţa plană spre obiect şi se numeşte lentilă frontală. (2) Puterea de mărire a ei este în raport direct cu mărimea unghiului de deschidere, adică cu unghiul format de razele de lumină divergente extreme, care plecând din punctul O, aflat pe obiect, pătrund în lentilă. (3) Puterea de mărire a unui obiectiv este cu atât mai mare cu cât diametrul lentilei sale frontale este mai mic. b. Între obiect şi lentila frontală trebuie să rămână întotdeauna un spaţiu de cel puţin 1,5 mm, numit distanţă frontală. (1) Acest spaţiu poate fi liber (aer) în cazul obiectivelor uscate sau, în cazul obiectivelor cu imersie, poate fi ocupat de un lichid cu indice de refracţie (n) apropiat cu al sticlei, cum este apa (n=1,33) sau egal cu al sticlei, în cazul uleiului de cedru (n=1,51). (2) La obiectivele uscate o mare parte din razele care pleacă dintr-un punct O al obiectului, a căror oblicitate faţă de axa optică a sistemului depăşeşte un anumit unghi, vor suferi o reflexie totală când ajung la faţa superioară a lamelei (ce acoperă obiectul aşezat pe lamă). Deci numai o parte a conului luminos pătrunde în obiectiv, restul fiind pierdut. (3) În cazul obiectivelor cu imersie, dacă se introduce între lentila frontală şi lamelă ulei de cedru, cu indicele de refracţie 1,51, egal cu al sticlei, sunt eliminate fenomenele de reflexie a luminii, precum şi fenomenele de refracţie. (a) Toate razele de lumină care pleacă din punctul O şi ajung pe lentila frontală, indiferent de oblicitate, pătrund microscop şi contribuie la formarea imaginii. (b) Deci obiectivele cu imersie dau o imagine mult mai luminoasă decât cele uscate fiindcă primesc toate razele conului de lumină corespunzător unghiului de deschidere. (c) În plus puterea de mărire a obiectivelor cu imersie este superioară celei a obiectivelor uscate, de asemenea se pot observa mai bine detaliile de structură ale obiectelor fiindcă şi rezoluţia obiectivelor cu imersie este mai bună. 2. Sistemul cu imersie. În urma refracţiei şi reflexiei datorită trecerii din sticlă în aer, o parte din razele de lumină provenite de la obiectul microscopic (preparat) se pierd, nu pătrund în obiectiv (razele de tip 1 din Fig. I-6). a. Punând pe lamela de sticlă un fluid cu indice de refracţie apropiat de cel al sticlei, de exemplu ulei de cedru (n=1,51) şi coborând sistemul microscopului până când lentila frontală a obiectivului se cufundă în ulei, aceste raze trec aproape nedeviate, intrând în obiectiv (vezi raza 2, Fig. I-6), contribuind astfel la îmbunătăţirea calităţii imaginii. b. Obiectivele cu imersie sunt obiective speciale, unele cu sistem telescopic pentru a realiza mai uşor apropierea de preparat fără a distruge lamela de sticlă. Puterea de mărire a acestor obiective poate fi de 60x, 90x, 100x sau 110x. c. Microscoapele moderne pot avea oculare ce măresc până la 20-25x, obiective cu imersie ce măresc până la 100-110x, precum şi sisteme intermediare de mărire (între obiectiv şi ocular). (1) Astfel mărirea finală în microscop poate ajunge la 2000-3000x, iar prin fotografierea imaginii şi mărirea acesteia se poate ajunge la măriri mai mari. (2) În plus folosind ca sursă de lumină o lampă cu lumină UV se pot obţine rezoluţii de până la 0,1 mm, la măriri finale (după fotografierea şi mărirea imaginii) de 6000-7000x. d. Examinarea în imersie are aplicaţii medicale importante, printre care: studiul bacteriilor, examinări hematologice, examinări de citogenetică.
C. Tehnica examinării în imersie 1. În continuare vom prezenta paşii care trebuie urmaţi pentru examinarea în imersie. a. Se plasează preparatul la microscop. Utilizând obiectivul de 10x se focalizează microscopul pe câmpul cel mai potrivit care conţine preparatul de examinat. Se centrează preparatul în câmpul de examinare, manipulând şuruburile laterale ale microscopului. b. Se schimbă obiectivul la 40x şi se refocalizează cu mai multă fineţe. Din nou se centrează câmpul de examinare. c. Se roteşte obiectivul la jumătatea distanţei între 40x şi 100x. d. Se pune o picătură de ulei de imersie pe lamă, în centrul câmpului de examinare. e. Se continuă rotirea revolverului până când cel de 100x ajunge în picătura de ulei. Sub nici o formă nu trebuie ca obiectivul de 40x sa ajungă în ulei. f. Folosind focalizarea de fineţe se refocalizează imaginea care ne interesează. g. Imediat după ce s-a terminat vizualizarea, se şterge uleiul de pe lamă şi de pe obiectivul de 100x, cu o cârpă înmuiată în xylol, toluen sau un substituent de xylol special pentru acest scop. 2. Aproape toţi solvenţii organici, în special xylolul şi toluenul sunt potenţial periculoşi, sunt inflamabili şi pot pătrunde in organism prin absorbţie directă la nivelul pielii sau plămânilor. Expunerea constantă la aceşti solvenţi a fost pusă în legătură cu afecţiuni hepatice şi chiar se consideră a fi implicate în carcinogeneză. Astfel este recomandată utilizarea tuturor solvenţilor cu precauţie şi în spaţii bine ventilate. 3. Odată ce uleiul de cedru este pus pe lamă, obiectivele de 10x şi de 40x nu vor mai fi folosite până după îndepărtarea uleiului. a. Uleiul distorsionează orice imagine vizualizată la magnificaţii mai mici. Astfel uleiul se foloseşte doar când este necesar şi atunci când nu se mai lucrează cu magnificaţii mici. b. Pentru utilizarea din nou a obiectivelor mici, uleiul se curăţă de pe lamă şi aceasta este lăsată la uscat. c. Deci microscopia cu imersie este utilizată doar când este neaparată nevoie şi numai după ce preparatul a fost atent examinat la magnificaţii mari, uscate (40x).
D. Preparat de examinat cu imersie. Cromatina sexuală (corpusculul Barr) în nucleii celulelor din mucoasa bucală (Fig. I-7). 1. Se degresează cu alcool sanitar 3 lame de sticlă curate. a. După igienizarea cavităţii bucale prin clătire de câteva ori cu apă, subiectul deschide gura şi se raclează cu o lamă mucoasa de pe faţa laterală a vestibulului bucal, îndepărtând astfel celulele moarte, detritusurile celulare şi saliva. b. Se repetă operaţia cu o altă lamă, recoltând celulele din epiteliul mucoasei bucale. c. Lama care conţine celulele recoltate se aduce în contact cu o lamă curată şi printr-o mişcare de glisare de-a lungul lamei curate se etalează celulele, obţinându-se astfel frotiul. Se lasă lama la uscat câteva minute. 2. Se colorează frotiul cu fuxină bazică, prin imersarea lamei, pe rând, în pahare Berzelius cu: 1) metanol absolut, 15-30 minute; 2) metanol 70%, 5 minute; 3) apă distilată, 10 minute; 4) fuxină bazică, 15-30 minute. 3. Se clăteşte lama cu apă la robinet pentru îndepărtarea excesului de colorant, apoi se introduce în: 5) metanol, 1 minut; 6) metanol absolut 1 minut. 4. În primele două soluţii are loc fixarea, în a treia rehidratarea, în a patra colorarea integrală a nucleilor, iar în ultimele două decolorarea nucleilor, cu excepţia corpusculului Barr, care are o afinitate mare pentru colorant, astfel încât rămâne colorat. 5. Se examinează lama la microscop cu obiectivul cu imersie. 6. De studiat: corpusculul Barr are aspectul unui mic triunghi colorat în violet închis cu baza la periferia nucleului sau poate avea formă semilunară sau de cupolă cu suprafaţa convexă spre interiorul nucleului, dar totdeauna tangent la periferia nucleului. Restul nucleului este colorat palid în roz-violet şi prezintă granule de cromatină. Corpusculii Barr nu se observă în toţi nucleii datorită poziţiei diferite în care pot fi situaţi.
|[pic] |
|Fig. I-6 Refracţia şi reflexia luminii prin aer (a) şi ulei (b) |
|[pic] |
|Fig. I-7 Evidenţierea cromatinei sexuale (săgeţi) |
Lucrarea nr. 12
Diviziunea celulară
Mitoza
În cea de-a patra perioadă a ciclului celular, perioada mitotică, au loc procese distributive de repartizare în celulele fiice a constituenţilor celulari sintetizaţi în interfază. Desfăşurarea diviziunii mitotice necesită diferenţierea în spaţiul intracelular a aparatului mitotic. Acesta este alcătuit din două componente: aparatul cromatic ( cromozomii ) şi aparatul acromatic ( fusul de diviziune şi centrii celulari ). Procesul distributiv al moleculelor de ADN se realizează prin mecanisme specializate, la eucariote cel mai frecvent întîlnite fiind mitoza şi meioza. Mitoza constituie tipul de diviziune caracteristic celulelor somatice ale tuturor organismelor eucariote. Ea este denumită şi diviziune ecvaţională sau conservativă deoarece în cadrul ei celula îşi conservă garnitura cromozomială iniţială, celulele fiice prezentînd acelaşi număr de cromozomi ca şi celula parentală.
[pic]
Se desfăşoară pe parcursul a 4 faze: profaza, metafaza, anafaza şi telofaza.
Profaza
Se caracterizează prin condensarea cromatinei şi individualizarea cromozomilor sub forma unor filamente subţiri, duble. Filamentele sînt intim asociate formînd un spirem (ghem). Cele 2 cromatide ce alcătuiesc cromozomii sînt unite la nivelul centromerului. Condensarea cromatinei continuă pe întreaga durată a profazei conducînd la scurtarea şi îngroşarea progresivă a filamentelor cromatidice. La începutul profazei centrul celular se divide generînd doi centrii celulari. Fiecare conţine o pereche de centrioli din care unul matur şi altul în creştere dispuşi perpendicular unul pe celălalt. Concomitent se înregistrează dezorganizarea microtubulilor citoplasmatici (parte componentă a citoscheletului interfazic) şi apariţia fusului de diviziune, structură bipolară alcătuită din microtubuli şi proteine asociate, dispusă între cei 2 centrii celulari. Fusul de diviziune se asamblează iniţial în afara nucleului. Prometafaza debutează prin fragmentara învelişului nuclear în vezicule delimitate de membrană ce staţionează pe întreaga durată a mitozei în jurul fusului de diviziune. Dezasamblarea membranei nucleare permite accesul fibrelor fusului de diviziune în regiunea nucleară. În prometafază pe cele 2 feţe opuse ale centromerului se maturează complexe proteice specializate în ancorarea cromozomilor de fibrele fusului numite kinetocori. Cei 2 kinetocori ai unui cromozom sînt capturaţi de fibrele fusului de diviziune ce pleacă din centrii celulari opuşi; acestea au fost numite fibre kinetocorice. Fibrele fusului rămase libere, orientate spre planul ecuatorial al celulei poartă numele de fibre polare.
Metafaza
Cromatina atinge condensarea maximă; cromatidele surori ale cromozomului metafazic sînt situate una în faţa celeilalte. Fibrele kinetocorice aliniază cromozomii într-un singur plan perpendicular pe axa fusului de diviziune, localizat la jumătatea distanţei ce separă polii celulari, formînd placa ecuatorială sau metafazică (cromatidele sînt orientate către periferia celulei iar centromerele formează placa ecuatorială). La sfîrşitul metafazei apare un clivaj care interesează atît cromatidele cît şi centomerele.
Anafaza
Se produce clivarea totală a celor 46 cromozomi bicromatidici în două grupe identice, fiecare dintre ele migrînd către polii opuşi ai celulei (cromatidele surori ale cromozomilor sînt deplasate spre oplii opuşi ai celulei cu viteză de aprox. 1 mm/min). Cromozomii anafazici monocromatidici suferă de regulă un proces de decondensare, însoţit de creşterea lor în lungime. La sfîrşitul anafazei cromozomii sînt grupaţi la cei doi poli ai celulei şi fibrele kinetocorice dispar.
Telofaza
În telofază se desfăşoară procese inverse celor ce au loc în profază. Decondensarea cromozomilor continuă; dacă la începutul telofazei aceştia au aspectul unor fibre fine, alungite şi încolăcite unele în jurul altora, la fiecare pol celular, spre sfîrşitul ei cromatina îşi reia aspectul caracteristic interfazic. Veziculele delimitate de membrană ce înconjoară fusul de diviziune fuzionează delimitînd cele două structuri nucleare nou formate la polii celulari opuşi. La nivel nuclear reîncepe sinteza ARN, avînd drept urmare reapariţia nucleolului. La sfîrşitul perioadei mitotice cele 2 celule fiice sînt încă unite printr-o regiune centrală ce conţine fibre polare ale fusului de diviziune parţial dezorganizate. Separarea completă a celulelor fiice, moment ce marchează desăvîrşirea diviziunii are loc la începutul următoarei interfaze.
Lucrarea nr. 13
Diviziunea celulară
Meioza
Meioza este întîlnită în procesul de gametogeneză şi reprezintă un tip de diviziune caracteristic celulelor germinale. Ea este denumită şi diviziune reducţională, caracterizîndu-se prin înjumătăţirea numărului de cromozomi în celulele progene. Meioza reprezintă un mecanism complex ce implică desfăşurarea succesivă a două diviziuni indirecte: meioza I ( diviziune reducţională ) şi meioza II ( diviziune conservativă ). Spermatocitele şi ovocitele de ordinul I, celule încă diploide, se multiplică prin diviziune reducţională ( meioza I ) formînd spermatocitele şi ovocitele de ordinul II, celule haploide, care la rîndul lor prin diviziune conservativă ( meioza II ) dau naştare gameţilor umani. Cele două diviziuni ce au loc în cadrul meiozei sunt precedate de o interfază premeiotică ( identică cu interfaza mitotică ) şi separate de o interfază scurtă, din care lipseşte perioada sintetică ( replicarea ADN ), numită interfază meiotică.
A. Prima diviziune a meiozei ( meioza I )
Meioza I are loc imediat după încheierea interfazei premeiotice, astfel încît la începutul acestei diviziuni ADN este complet replicat ( celulele sunt tetraploide ), fiecare cromozom fiind alcătiut din două cromatide surori. Cromozomii bicromatidici omologi ( matern şi patern ) se grupează în perechi formînd o structură tetracromatidică numită cromozom bivalent sau tetradă. Cromatidele nesurori ale bivalentului sunt antrenate în procese de remaniere cromozomială. Separarea ulterioară a cromozomilor omologi, translocarea acestora spre polii celulari opuşi şi citokineza conduc la formarea a două celule progene. Fiecare progen conţine cîte două copii ale unui singur cromouom din fiecare pereche de omologi ai celulei parentale ( jumătate din numărul cromozomilor celulei mamă ). Copiile sunt asociate formînd un cromozom bicromatidic. Similar mitozei somatice, în cadrul meiozei I, se disting cinci etape: profaza, prometafaza, metafaza şi telofaza. Meioza I se încheie cu procesul de citokineză.
a. Profaza meiozei I ( profaza I ) Profaza I se deosebeşte de profaza mitotică atît sub aspectul duratei (90-95% din desfăşurarea meioei I), cît şi sub aspectul evenimentelor ce au loc în această etapă. Profaza I este împărţită în cinci stadii succesive: laptoten, zigoten, pachiten, diploten şi diachineză. Leptotenul se caracterizează prin condensarea cromatinei şi individualizarea cromozomilor sub forma unor filamenta lungi şi subţiri. Deoarece în perioada S a interfazei, materialul genetic al celulei parentale (2N) a fost replicat, celula în laptoten este tetraploidă (4N). Fiecare cromozom este alcătuit din două cromatide surori unite la nivelul centromerului şi intim asociate, ceea ce conferă cromozomului un aspect monocromatidic. Cromozomii sunt ataşaţi cu ambele capete de învelişul nuclear prin intermediul unor structuri specializate numite plăci de ataşare. La sfîrţitul laptotenului, pe o singură parte, în lungul fiecărui cromozom se diferenţiază o lamă proteică numită axă. Cromatina ce formează cromatidele surori proemină sub forma unei bucle, pe faţa opusă. Zigotenul reprezintă stadiul în care are loc conjugarea cromozomilor omologi, proces numit sinapsis (sinapsare sau formarea sinapsei). Conjugarea este anticipată de apropierea omologilor. Recunoaşterea şi gruparea cromozomilor omologi în pereche se realizează prin intermediul proteinelor ce intră în alcătuirea axelor, dar şi pe seama învelişului nuclear de care cromozomii continuă să rămînă ataşaţi. Conjugarea cromozomilor omologi poate fi iniţiată de la o extremitate a acestora sau din una sau mai multe regiuni centrale. Iniţierea conjugării implică interacţii între perechile de baze complementare ale ADN din regiuni cromozomiale specifice numite zigomere sau sinapsomere. Prin stabilirea interacţiilor se realizează alinierea cromozomilor, astfel încît fiecare genă dintr-un cromozom este juxtapusă genei omoloage din cromozomul pereche. Din punctele de iniţiere conjugarea se extinde progresiv, cuprinzînd integral cromozomii prealiniaţi într-o manieră zipper like (zipper = fermoar). Rezultatul desăvîrşirii conjugării îl constituie formarea bivalenţilor, numiţi şi tetrade, denumire sugerată de numărul cromatidelor ce-i alcătuiesc. În momentul conjugării, cele două axe ale cromozomilor omologi sunt dispuse faţă în faţă, constituind elementele laterale ale unei structuri numite complex sinaptonemal. Pachitenul începe în momentul desăvîrşirii conjugării cromozomilor. Principalul eveniment ce caracterizează pachitenul este crossing-over-ul, fenomen ce implică ruperea în aceeaşi poziţie a extremităţii unei cromatide materne şi a alteia paterne şi reuniunea încrucişată a fragmentelor. Prin schimbul reciproc de fragmente între cromatidele nesurori se realizează recombinarea genetică. Fiecare cromozom va conţine gene aparţinînd ambilor genitori, noua combinaţie de gene creată transmiţîndu-se generaţiilor următoare. Procesul de recombinare este catalizat de către complexe multiproteice numite noduli de recombinare. Diplotenul reprezintă stadiul în care are loc separarea parţială a omologilor prin dezorganizarea complexului sinaptonemal. Cromozomii omologi rămîn ataşaţi la nivelul situsurilor în care a avut loc crossing-over-ul; aceste puncte de ataşare poartă numele de chiasme. Concomitent cu desinapsarea omologilor are loc separarea cromatidelor surori ce rămîn unite prin centromer. Bivalenţii pot prezenta una sau mai multe chiasme, numărul lor ilustrînd frecvenţa crossing-over-ului. În meioza I, chiasma joacă un rol similar celui pe care îl are centromerul în mitoză, asigurînd segregarea corectă a materialului genetic. Absenţa chiasmelor într-un bivalent face imposibilă segregarea cromozomilor omologi în următoarele etape ale meiozei, fenomen cunoscut sub numele de nondisjuncţie. În acest caz o parte din gameţii rezultaţi vor avea un cromozom în minus, în timp ce alţii vor conţine o copie cromozomială în plus. În diachineză cromozomii se detaşează de membrana nucleară. În fiecare bivalent cromozomii omologi sunt uniţi prin intermediul chiasmelor, iar cromatidele surori ale fiecărui cromozom din pereche sunt legate prin intermediul centromerului.
b. Prometafaza meiozei I ( prometafaza I ) În prometafaza I se dezorganizează învelişul nuclear şi se formeată aparatul acromatic. La nivelul centromerelor se diferenţiază kinetocorii. Cei doi kinetocori ce se dezvoltă pe centromerul unui cromozom din bivalent sunt ancoraţi de fibrele kinetocorice ce pleacă de la acelaşi pol al fusului de diviziune. Kinetocorii de pe centromerul cromozomului omolog sunt legaţi prin fibre kinetocorice de polul opus.
c. Metafaza meiozei I ( metafaza I ) Mobilizarea bivalenţilor spre regiunea acuatorială a celulei şi alinierea lor în placa metafazică constituie principalele evenimente din această etapă. Chiasmele localizate terminal menţin cromozomii omologi uniţi pe toată durata metafazei I. Sfîrşitul acestei etape este marcat de dispariţia chiasmelor şi eliberarea cromozomilor din bivalent.
d. Anafaza meiozei I ( anafaza I ) Odată eliberaţi din tetradă, cromozomii omologi sunt translocaţi spre polii celulari opuşi ai celulei. Spre deosebire de cromozomii momocromatidici din anafaza mitotică, cromozomii din anafaza meiozei I sunt bicromatidici. Migrarea la polii celulari ai cromozomilor bicromatidici conduce la reducerea la jumătate a numărului de cromozomi prezenţi iniţial în celula parentală. Concomitent începe procesul de decondensare a cromozomilor.
e. Telofaza meiozei I ( telofaza I ) În telofaza I cromozomii se găsesc la polii fusului de diviziune. Decondensarea cromozomilor continuă fără ca aceştia să-şi piardă individualitatea; membrana nucleară se reorganizează delimitînd cei doi nuclei rezultaţi în urma diviziunii. Meioza I se încheie cu procesul de citochineză prin care sunt separate celulele progene. Fiecare progen conţine o jumătate din garnitura cromozomială a celulei parentale, deşi cantitatea de ADN corespunde unei celule diploide. Aceasta se explică prin existenţa în fiecare celulă a două copii ale aceluiaşi cromozom. Datorită recombinării genetice ce are loc în profaza I, copiile nu sunt perfect identice.
B. A doua diviziune a meiozei ( meioza II ) Meioza II reprezintă o diviziune mitotică, ecvaţională, ce asigură repartiţia egală a copiilor cromozomiale din cele două celule fiice şi în consecinţă formarea gameţilor.
[pic]
LUCRAREA PRACTICA 14
CARIOTIPUL SI CARIOGRAMA
Cromozomii umani • La începutul diviziunii, cromatina se organizează în cromozomi, organite nucleare care fixează intens coloranţii bazici (“chroma" – culoare; “soma" – corp) şi îndeplinesc două funcţii importante: o transportă materialul genetic de la părinţi (prin gameţi) la descendenţi, precum şi de la o celulă „mamă" la celulele „fiice", în cursul multiplicării celulare, asigurând stabilitatea proceselor ereditare; o realizează amestecul materialului ereditar între generaţii succesive, prin procesele de recombinare ce au loc în meioză, sursa principală de variabilitate. • Anomaliile de număr şi structură ale cromozomilor sunt implicate în numeroase stări patologice şi, de aceea, explorările citogenetice reprezintă o metodă importantă de diagnostic în medicina clinică (sindroame plurimalformative, debilităţi mintale şi tulburări de comportament, tulburări de sexualizare şi reproducere, cancer).
Morfologia cromozomilor umani • Numărul şi morfologia cromozomilor sunt elemente caracteristice pentru fiecare specie. La om, în celulele somatice diploide, există în mod normal 46 de cromozomi, iar în gameţi (celule haploide) doar 23 de cromozomi. După fecundare, la zigot se reface numărul diploid şi se realizează 23 perechi de cromozomi omologi, identici ca mărime, formă şi conţinut genic - dar diferiţi ca origine. 22 perechi de cromozomi sunt identice la cele două sexe şi se numesc autozomi; o pereche diferă însă la cele două sexe, numindu-se cromozomi sexuali sau gonozomi: XX la femeie şi XY la bărbat. • Cromozomii sunt cel mai uşor de analizat în stadiul de metafază sau prometafază a mitozei, deoarece se află în acelaşi plan (în „placa ecuatorială") şi sunt bine individualizaţi. În aceste stadii, ei sunt alcătuiţi din două cromatide unite la centromer şi delimitate la capete prin telomere. • Cromatidele unui cromozom sunt subunităţi longitudinale identice („cromatide-surori") care posedă fiecare o singură moleculă de ADN asociată cu proteine sau, mai exact, o fibră de cromatină puternic condensată. • Centromerul este locul în care cromatidele surori sunt ataşate prin intermediul unor proteine, formând constricţia primară. Cromozomii au în mod normal un singur centromer. Poziţia centromerului la fiecare cromozom este fixă, fiind determinată de o secvenţă particulară de ADN centromeric, înalt repetitiv, aceeaşi la toţi cromozomii. • Centromerul împarte cromatidele în două braţe, notate convenţional cu p (de la petit) pentru braţul scurt şi q (de la qeue) pentru braţul lung. După poziţia centromerului, cromozomii pot fi: o metacentrici (cu centromerul în mijlocul cromozomului şi braţele aproximativ egale); o submetacentrici (cu centromerul în afara zonei centrale şi braţele de lungimi diferite); o acrocentrici (cu centromerul spre un capăt al cromozomului). • Funcţia centromerului este de a asigura distribuţia egală a fiecărui cromozom, prin mitoză, de la celula „mamă" la celulele „fiice". În acest proces, AND-ul centromeric determină fixarea specifică a unor proteine care vor forma kinetocorii, locul de fixare a microtubulilor filamentelor fusului de diviziune (în metafază), care vor asigura tracţiunea şi deplasarea cromatidelor la polii fusului de diviziune. • Telomerele sunt structuri specializate formate din ADN şi proteine care acoperă capetele cromozomilor. Ele prezintă un bloc (3-20 kb) de ADN repetitiv format din secvenţe scurte de (5'-TTAGGG-3'), repetate în tandem, de câteva mii de ori; ele sunt identice la toţi cromozomii şi perfect conservate în evoluţie. • Telomerele au următoarele funcţii probabile: o Menţinerea stabilităţii si integrităţii structurale a cromozomului, apără capetele cromozomilor de degradare şi împiedică fuziunea „cap la cap" cu alţi cromozomi; pierderea telomerelor produce capete cromozomice instabile, care au tendinţa de a fuziona cu capetele altor cromozomi rupţi, formînd diferite tipuri de aberaţii structurale. o Asigurarea replicării complete a capetelor cromozomului. Procesul se realizează cu ajutorul unei telomeraze; reducerea activităţii sale produce o pierdere treptată a secvenţelor telomerice, la fiecare replicare; acest fenomen va duce la scurtarea progresivă a telomerelor, până la un moment critic ce va bloca diviziunea celulei. Aceasta ar putea fi o explicaţie a duratei limitate de viaţă a celulelor somatice. o Participarea la stabilirea arhitecturii tridimensionale a nucleului (cromozomii se fixează cu telomerele pe faţa internă a membranei) şi/sau la iniţierea sinapsei corecte a cromozomilor omologi la începutul profazei meiozei I. • Benzile cromozomice, elemente specifice fiecărui cromozom. Prin diferite tratamente (digestie enzimatică, denaturare termică etc.) şi/sau încorporarea unor coloranţi specifici pentru ADN (Giemsa, Quinacrină etc), cromozomii metafazici apar alcătuiţi dintr-o serie continuă de benzi transversale, în care zone intens colorate (benzi G) alternează regulat cu altele, mai slab colorate (benzi R). Fiecare cromozom are un model caracteristic al poziţiei, succesiunii, mărimii şi intensităţii benzilor, ce permite identificarea sa precisă. Acest model este identic în toate celulele corpului şi la toţi indivizii speciei. Mărimea benzilor este cuprinsă între 1 şi 10 Mb. Benzile sunt markeri citologici ai structurii interne heterogene a cromozomilor; ele reflectă în primul rând gradul de compactare (condensare) a fibrei de cromatină în lungul cromozomilor.
Clasificarea şi nomenclatura cromozomilor umani • Clasificarea actuală utilizează International System of Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN, 1995). Pe baza lungimii şi poziţiei centromerului si a dimensiunilor lor, cromozomii umani au fost clasificaţi în 7 grupe, notate (convenţional) de la A la G. Autozomii sunt desemnaţi fiecare printr-un număr de la 1 la 22. Se obţine astfel o aranjare sistematizată a cromozomilor unei celule numit cariotip.
• Pentru a descrie sintetic un cariotip normal sau anormal, ISCN a stabilit un sistem de nomenclatură şi o serie de abrevieri. Formula de bază cuprinde 3 itemi, separaţi prin virgulă: primul precizează numărul de cromozomi, al doilea constituţia (normală/anormală) a cromozomilor sexuali, iar al treilea (prezent în funcţie de situaţie) anomaliile de număr sau structură ale autozomilor. Prezenţa unui mozaic cromozomic este indicată printr-o diagonală (/) care separă cariotipurile liniilor celulare componente.
CARIOTIPAREA DIN LEUCOCITE UMANE
Cultura: • Se recoltează sânge în seringă heparinizată • Se pun 0,5 ml sânge în 5 ml mediu de cultură • Se incubează 72 ore la 37°C
Colchicinizarea:
• Cu 15 min. înainte de expirarea celor 72 ore se adaugă în cultură 100μl soluţie colchicină (10μg/ml)
Prelucrare:
• Se centrifughează proba 10 min la 1000 rot/min • Se decantează supernatantul (rămâne aprox. 1-1,5 ml) • Se adaugă aprox. 8 ml sol. hipotonă (KCl 560mg în 100ml apă distilată) • Hipotonizarea durează 25 min la 37°C • Se centrifughează 10 min la 1000 rot/min • Se decantează supernatantul (rămâne aprox. 1-1,5ml) • Fixarea I: se adaugă picătură cu picătură 5 ml sol. fixatoare (acid acetic glacial + alcool metilic absolut = 1/3) • Se centrifughează 10 min la 1000 rot/min • Se decantează supernatantul (rămâne 0,5-0,8ml) • Fixarea II: se adaugă 5ml sol. fixator, se barbotează • Se centrifughează 10 min. la 1000 rot/min • Se decantează supernatantul (rămâne 0,5 ml) • Fixarea III: se adaugă 5 ml soluţie fixatoare • Se păstrează la frigider 24 ore • Fixarea IV: se centrifughează 10 min la 1000 rot/min • Se decantează supernatantul (rămâne 0,5 ml) • Se prepară sol. fixatoare proaspătă 5 ml • Se centrifughează 10 min la 1000rot/min • Se decantează supernatantul (rămân aprox. 0,3 ml) • Se resuspendă celulele în fixator, în funcţie de abundenţa celulelor până la o concentraţie favorabilă
Etalarea (prepararea lamelor): • Se etalează proba (suspensia de celule) pe lame curate, umede şi reci (spălate cu apă şi detergent lichid, clătite la jet şi apoi în apă distilată; păstrate la frigider în apă distilată) • Se “împrăştie” pe lamă 44μl suspensie de celule cu ajutorul pipetei automate • Se usucă la aer sau sub lampa cu raze infraroşii • După 4-5 zile se bandează
Bandarea G a cromozomilor:
Materiale: • Tampon PBS (phosphate-buffered saline) cu pH 7. Dizolvaţi 8g NaCl, 0,2g KCl, 0,92g fosfat anhidru de sodiu (Na2HPO4) şi 0,2g fosfat anhidru de potasiu (KH2PO4) într-un litru de apă distilată • 0,05% soluţie tripsină. Dizolvaţi 35mg tripsină în 70 ml PBS. Soluţia este stabilă pentru aproximativ o zi. • Colorant Giemsa. 3ml de soluţie Giemsa şi 30ml apă distilată.
Protocol:
• Scunfundarea lamele pentru 30-35 sec. în sol. de tripsină • Spălarea lamelor prin soluţiile PBS I şi II • Colorarea lamelor pentru 6 min. în sol. Giemsa • Spălarea lamelor în apă distilată şi uscare la aer • Se montează lamela folosind un mediu de montare (ex. Entellan-Merck) • Se examinează la microscop metafazele favorabile, se fotografiază, se decupează cromozomii, se analizează eventuale anormalităţi
Celulele organismului uman, cu excepţia celulelor nervoase sunt capabile să se multiplice, să formeze două celule fiice cu aceleaşi caractere morfologice şi funcţionale ca şi celula mamă. Prin diviziune celulară se realizează un proces de diferenţiere şi creştere, de menţinere a structurii şi funcţiilor organismelor precum şi reproducerea lor.
La om, multiplicarea celulară se face prin: • diviziune indirectă, cariokineză sau mitoză; • diviziune directă sau amitoză (în unele situaţii).
Metode de studiu.
Evenimentele care caracterizează multiplicarea sunt studiate prin tehnici variate care pun în evidenţă structuri sau edificii moleculare apărute în această etapă a ciclului celular.
Observarea în microscopia fotonică. Celulele pot fi observate fie in vivo (culturi de celule) fie pe secţiuni, după fixare, cu ajutorul microscopului fotonic obişnuit, cu contrast de fază, cu fluorescenţă, etc. Observarea in vivo permite înregistrarea mişcărilor celulare prin microcinematografie ceea ce aduce o contribuţie importantă la studiu diviziunii pe plan dinamic.
Observarea în microscopia electronică permite identificarea structurilor nucleare şi citoplasmatice care participă la mitoză: microtubulii fusului de diviziune, microfilamente, centrioli, cromozomi.
Utilizarea antimitoticelor de tipul colchicinei, vinblastinei, vincristinei care inhibă polimerizarea dimerelor de tubulină, permit studiul optic al fusului de diviziune şi a cromozomilor.
Izolarea aparatului mitotic se realizează prin stabilizarea aparatului mitotic cu agenţi chimici (glicoli cu lanţ lung sau solvenţi organici) şi înlăturarea altor constituienţi celulari printr-un detergent.
Diviziunea indirectă produce modificări morfologice şi biochimice atât la nivel nuclear cât şi citoplasmatic. Ea prezintă două forme: • mitoza somatică sau propriu-zisă (ecuaţională); • mitoza reducţională sau meioza
1. Mitoza somatică
Prin mitoza somatică sau ecuaţională, zestrea genetică maternă se împarte în mod egal între cele două celule fiice (set cromozomal diploid) şi se desfăşoară în patru etape succesive: profaza, metafaza, anafaza şi telofaza. • Profaza se caracterizează prin apariţia în nucleu a cromozomilor prin spiralizarea fibrelor cromatiniene care migrează către periferia nucleului; centromerul sau kinetocorul a cărui poziţie este constantă pentru fiecare cromozom devine vizibil. În citoplasmă cei doi centrioli se depărtează unul de celălalt, între ei apărând microtubulii cu dispoziţie radiară (microtubulii astrali). Înaintea celei de a doua etape, învelişul nuclear şi nucleolul dispar progresiv iar cromozomii migrează către planul ecuatorial al celulei; kinetocorii sunt mai evidenţi şi devin funcţionali determinând organizarea microtubulilor fusului de diviziune (microtubuli kinetocori). • În metafază cromozomii se scurtează prin accentuarea spiralizării şi ocupă un plan care corespunde ecuatorului celulei formând placa ecuatorială; cromatidele sunt orientate către periferia celulară iar centromerele formează placa ecuatorială. La sfârşitul metafazei, la nivelul fiecărui cromozom apare un clivaj longitudinal care interesează atât cromatidele cât şi centromerele. • Anafaza – se produce clivarea totală a celor 46 de cromozomi în două grupe identice (92 cromozomi); fiecare din ele migrând către polii opuşi ai celulei. Spre sfârşitul anafazei cele două loturi de cromozomi ocupă cei doi poli ai celulei iar zona de citoplasmă care-i separă este ocupată de microtubuli interzonali. • în Telofază cromozomii se despiralizează; apare învelişul nuclear şi din organizatorii nucleolari se formează nucleolii. Şanţul de diviziune apărut la sfârşitul anafazei se adânceşte progresiv în plan ecuatorial, perpendicular pe fasciculele de microtubi interzonali. Organitele se repartizează aproximativ egal în vecinătatea fiecărui nucleu, mişcările periferice diminuă progresiv iar cele două celule fiice se separă complet.
[pic]
2. Mitoza reducţională (Meioza).
Mitoza reducţională sau meioza este diviziunea care are loc în cursul gametogenezei şi care asigură reducerea la jumătate a numărului de cromozomi (set haploid de cromozomi = 23). Ea se derulează în gonade (testicul şi ovar) şi constituie unul din fenomenele cele mai importante ale evoluţiei liniei germinale.
Spermatocitele şi ovocitele de ordinul I, celule încă diploide se multiplică prin meioză formând spermatocitele şi ovocitele de ordinul II, celule haploide.
Diviziunea reducţională se derulează tot în patru faze ca şi mitoza somatică: profaza, metafaza, anafaza şi telofaza. Caracteristică este profaza primei mitoze a meiozei care are cinci etape: leptoten, zigoten, pachiten, diploten şi diachineză. • Profaza este etapa cea mai lungă în care se realizează reducerea numărului de cromozomi. o Stadiul leptoten începe odată cu creşterea în volum a nucleului, replicarea ADN cromozomial şi diferenţierea cromozomilor care se găsesc în număr diploid. o Stadiul zigoten se caracterizează prin acolarea longitudinală a cromozomilor omologi (fiecare autozom de origine maternă se acolează la autozomul omolog de origine paternă). O astfel de pereche ia numele de cromozom bivalent sau diadă. La sfârşitul acestei faze se găsesc 22 cromozomi bivalenţi. Cromozomii sexuali (xy şi xx) alcătuiesc o formaţiune cunoscută sub numele de veziculă sexuală. o Stadiul pachiten – la nivelul fiecărei cromatide din diadă apare un clivaj longitudinal care determină apariţia a două cromatide paralele. În urma acestui clivaj, fiecare bivalent va avea patru cromatide alcătuind o tetradă. În această fază are loc un schimb de material genetic între cromatidele de origine paternă şi cele de origine maternă, schimburi realizate prin legături chiasmatice (crossing over). o Stadiul diploten se caracterizează prin separarea cromozomilor omologi din fiecare bivalent, ei rămânând legaţi numai la nivelul chiasmelor. o Stadiul de diakineză. Cromozomii bivalenţi migrează spre periferia nucleului, legăturile lor chiasmatice reducându-se foarte mult. Se individualizează cromozomii sexuali (xy sau xx). Dispare nucleolul iar membrana nucleară se dezintegrază.
[pic]
• Metafaza. Cromozomii ocupă planul ecuatorial al celulei iar pe fiecare centromer se inseră microtubulii fusului de diviziune. • Anafaza. Cromozomii din fiecare bivalent se separă, fenomen denumit disjuncţie şi migrează spre polii celulei. • Telofaza. Marchează începutul formării celor două celule fiice a spermatocitelor şi ovocitelor II, cu echipamentul cromozomial redus la jumătate (formula haploidă, n=23 cromozomi).
3. Diviziunea de maturaţie.
A doua diviziune a meiozei se desfăşoară conform unei mitoze somatice, realizând o diviziune ecuaţională dar pe celule deja haploide (23 cromozomi), în urma căreia se formează spermatidele şi ovoitidele.
Amitoza sau diviziunea directă
Prin diviziunea directă se formează două celule fiice prin simpla strangulare a nucleului şi a citoplasmei celulei mame, fără apariţia cromozomilor, după autoreplicarea materialului genetic. Se întâlneşte în hepatocite, celule cartilaginoase şi osoase.
În unele cazuri (hepatocite) diviziunea nucleului nu este însoţită şi de separarea celuleor (citokineză) ducând la apariţia celulelor bivalente.
