Genetik Grundbog

Vigtigese processer med nukleinsyrer:

DNA -> DNA (replikation)
DNA -> RNA (transkription
RNA -> protein (translation)
RNA -> DNA (revers transkription)

Organisme typer:

1. Autotrofe: kan opbygge organiske molekyler ud fra uorganiske stoffer a) kemoautotrofe: bruger kemisk energi til opbygning af organiske stoffer fra uorganiske (få bakterier) b) fotoautotrofe: bruger lysenergi (planter, alger, få bakterier) 2. Heterotrofe: får energi ved at nedryde organiskestoffer optaget fra omgivelserne

fotoautotrofe processer: fotosyntesen hetoerotrofe processer: respiration gæring

Cellen

Prokaryoter:
Før kerne=ingen kerne

Baktierier. Blågrønalger. Fleste prokaryoter er encellede.
Arveanlæg et stort ringformet kromosom. Har desuden plasmider, ringformede DNA-molekyler. Kan indholde antibiotikaresistents. Bakterien kan kopier pladsmidet uafhængigt af resten af cellen. Og overføre plasmidet til andre bakterier.
Kan modtage DNA på forskellige måder.
Transformation (optagelse fra omgivelserne)
Konjugation (via parringsrør , F-pilus)
Transduktion: overførsel med virus.
Prokaryoter har heller ikke mitokondrier, grønkorn, golgi apparat.
Har ribosomer

Eukaryoter flest flercellede. Kun protister er encellede (f.eks eukaryotiske alger)
Cellemembran består af dobbeltlag af phosfolipider og er derfor selektiv permeabel fedtdråber kan jo ikke blande sig med vand
Proteiner indlejret som transportkanaler og receptorer. ransport
Består af cytoplasma kerne (nukleus) har ydre og indre membran med porer til transport.
Nukleolen produktion af ribosomer. Dna i kromosomerne. Kromosomernes antal er karakteristisk for arten.

Organeller:

Mitochondrierne: respiration. Cellens energi. C6H12O6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H2O + energi (ca. 30 ATP-molekyler (= 40%) + 60% varme).
Det endoplasmatiske retikulum til produktion og transport af fedtstoffer og proteiner.
Golgi apparat. Til transport/indpakning af små molekyler i veksikler. Eksport.
Peroxisomer. Nedbrydning og omdannelse af aminosyrer, nitrogenholdige baser, lipider, alkohol
Ribosomer. (frie eller i ER) Proteinsyntese.
Lysosomer: blære med fordøjelsesenzymer til nedbrydning af proteiner, lipider, nukleinsyrer.

Deler op i plante og dyrecelle. Forskel. Plantecelle har cellevæg af cellulose, grønkorn til fotosyntese og vakuoler: Forrådsblærer
Dyrecellen har centrioler.
Centrioler (kun dyr). Cylindriske dannet af mikrotubuli. Til celledeling.

- Både grønkorn og mitochondrier har dobbeltmembran og egent selvstændige DNA-molekyle. Kan dele sig uafhængigt af cellen.
Anses derfor for at have været prokaryote celler.

Fosterudvikling og celledelinger

Celledelinger:
Formål: vækst, vedligeholdelse, formering
Større organismer bestående af mange celler, altså vækst forudsætning for vækst. Da Store celler kan ikke skaffe næring nok til overlevelse.

Vedligeholdelse:
Beskadigede celler, slidte celler eller celler med kort levetid, må udskiftes. Eksempler, sårheling, immunforsvar mavens slimhinde, rødeblodlegmer

Celledeling er en forudsætning for formering. Ud fra en celle dannes 2 ( 4 ( 8 ( 16 ( 32 osv. Celler. Formering kaldes ukønnet formering eller vegetativ formering, fordi den ikke er forløbet på sammensmeltning af to kønsceller. Ved ukønnet formering skabes en genetisk kopi af modercellen. Dette ses oftest hos encellede organisme, men kan også forekomme hos flercellede organismer specielt i planteriget. De celledelinger, der er grundlaget for vækst, vedligeholdelse og ukønnet formering kaldes vækstdelinger eller mitoser.
Ved kønnet formering dannes nye individer som genetisk adskiller sig fra forældrene. Det sker ved at forældrenes kønsceller (kaldet gameter) smeltes sammen som kaldes befrugtning. Under befrugtning smelter kønscellernes kerner sammen, hvorved kromosom tallet i den befrugtede celle fordobles. For at kromosomtallet i afkommet ikke skal fordobles er der kun halvt så mange kromosomer i kønscellerne som i kroppens øvrige celler. Derfor er den celledeling der fører til dannelsen af kønsceller forskellig fra mitosen. Dannelsen af kønsceller, hvor kromosomtallet er halveret kaldes meiose.

Formålet ved celledeling: • Vækst

• Vedligeholdelse

• Formering

Vækst
Større organismer består af mange celler, da store celler ikke kan skaffe næring nok selv til egen overlevelse. For større organismer er celledeling altså en forudsætning for vækst.

Vedligeholdelse
Celledelinger vil konstant finde sted, selv når man er fuldt udvokset, da organismens celler bliver beskadiget og må erstattes med nye celler. Eksempel på dette er sårheling, hvor såret fyldes med størknet blod. Det størknede blod erstattes derefter af nye hudceller der opstår ved deling af intakte hudceller i sårets kant. Andet eksempel er reproduktionen af de røde blod legemer der har en leve tid på 100 dage.

Formering
Celledeling er en forudsætning for formering. Ud fra en celle dannes 2 ( 4 ( 8 ( 16 ( 32 osv. Celler. Formering kaldes ukønnet formering eller vegetativ formering, fordi den ikke er forløbet på sammensmeltning af to kønsceller. Ved ukønnet formering skabes en genetisk kopi af modercellen. Dette ses oftest hos encellede organisme, men kan også forekomme hos flercellede organismer specielt i planteriget. De celledelinger, der er grundlaget for vækst, vedligeholdelse og ukønnet formering kaldes vækstdelinger eller mitoser.
Ved kønnet formering dannes nye individer som genetisk adskiller sig fra forældrene. Det sker ved at forældrenes kønsceller (kaldet gameter) smeltes sammen som kaldes befrugtning. Under befrugtning smelter kønscellernes kerner sammen, hvorved kromosom tallet i den befrugtede celle fordobles. For at kromosomtallet i afkommet ikke skal fordobles er der kun halvt så mange kromosomer i kønscellerne som i kroppens øvrige celler. Derfor er den celledeling der fører til dannelsen af kønsceller forskellig fra mitosen. Dannelsen af kønsceller, hvor kromosomtallet er halveret kaldes meiose.

Celledelingerne mitose og meiose • Mitose forekommer ved vækst, vedligeholdelse og ukønnet formering

• Meiose forekommer ved kønscelledannelse (kønnet formering)

Celledeling ved mitosen forløber som en cellecyklus kaldet interfasen (figur i bogen). Ud af interfasen dannes to identiske datterceller ud fra modercellen. Udover interfasen findes også en fase som kaldes G0-fasen i bogen. Denne fase er en slags endestation for cellerne hvor de ikke deler sig mere.

Celledeling ved meiosen har to delinger.
I første meiotiske deling sker der en overkrydsning så der udveksles gener mellem moderens og faderens kromosom. Herved opstår der nye kombinationer af gener på de enkelte kromosomer.
I anden meiotiske deling adskilles de to kromatider i hvert kromosom og bevæger sig til hver sin datter celle, så hver dattercelle indeholder hver 23 kromosomer. I meiosen produceres der 4 forskellige datterceller ud fra én modercelle.
Cellediffenrentiering og fosterudvikling
Udviklingen af fosteret sker når sædcellen og ægcellen smelter sammen til hvad der kaldes en zygote. Zygoten indeholder 46 kromosomer, da sæd og ægcelle indeholder et sæt arveanlæg med 23 kromosomer. Fosterudviklingen omfatter tre processer: • Vækst

• Celledeling

• Celledifferentiering

Vækst: vokse større
Celledeling
Celledelingen er forudsætningen for vækst som i alle andre større organismer. UD fra zygoten dannes der ved mitoser omkring 100 billioner nye celler frem til fødslen.
Celledifferentiering
Celledifferentiering betyder at cellerne i fosteret bliver mere og mere forskellige. Ud fra zygoten opstår nye forskellige celler der hver især er specialiseret til en bestemt funktion. Zygoten udvikles blandt andet til en nervecelle.
Den første del af foster udviklingen finder sted lige efter befrugtningen. Det sker ved celledelinger dog uden at medføre vækst. Dvs. forøgelse af massen. DNA’et er ikke virksomt under de første celledelinger, hvilket kaldes genom-tavshed. Der dannes 4 små celler ud fra zygoten som er totipotente. Det betyder at cellerne kan deles og udvikle sig til et nyt individ. Tvilling.

Efter 4-cellestadiet er der for lidt mRNA til at der kan ske en ny celledeling. Cellernes DNA skal derfor i gang for at producere nyt mRNA. Herved tabes evnen til at være totipotent. Cellerne bevarer dog en vis alsidighed og kan ved yderligere differentiering blive til forskellige celletyper. Dette kaldes pluripotente. Denne evne tabes dog også efterhånden som cellerne bliver differentieret. Enkelte beholder dog denne egenskab i voksen livet og de celler kaldes stamceller.

Kløvning er celledeling uden efterfølgende vækst. Mitoser ved kløvning er hurtigere end normale celledelinger. Kløvning – få timer (normal flere dage)
Kløvning i zygoten når den er på vej mod livmoderen. Dannes flere hundrede af celler ud fra zygoten. Sker inde for ægcellens oprindelige kapsel, fylder det samme.
Morula kaldes denne celleklump dannet ved kløvning.

Morula optager næring -> blære/væskefyldt hulrum kaldet blastocyt/blastula med indre cellemasse kimskiven der udvikles til det egentlige foster (embryon/embryo), fosterhinden og navlestrengen.
Ca. Efter en uge hænger blastocytten fast i livmoderens cellevæg -> implantation.

Kimskiven danner 3 kimblade (cellelag) der udvikler sig til fosterets organer
Ektoderm: hud hår negle, svedkirtler, nethinde, linse, tandemajle, ydre øre, nervesystem, binyremarv og hypofyse
Mesoderm: skelet, muskler, bindevæv, hjerte, blodkar, nyre, kønsorganer og bynyrebark.
Endoderm: fordøjelseskanal, lever, bugspytkirtel, brissel skjoldbruskkirtlen, biskjoldbruskkirtlen, luftrør, lunger, urinleder og det meste af blæren.

Organsystemer anlægges de første 3 måneder, i denne periode er fosteret meget følsomt fra udefrakommende påvirkninger (sygdom, medicin f.eks.)
Først efter 5. Uge begynder kønsudviklingen. Indtil da er fosterets fænotype intetkøn.

DNA og RNA

DNA: deoxiribosenukleinacid
RNA: ribosenukeleinacid

Opbygget af nukelotider: 1) en phosphatgruppe 2) et kuhydrat ( henholdsvis deoxiribose eller ribose) 3) en nitrogenholdig base: enten adenin (A), cytosin (C), guanin (C), thymin (T) hos RNA er thymin udskiften med uracil.
Puriner: A og G
Pyrimidiner: U,T og C
.
DNA – to antiparallelle polynuleotidkæder der tilsammen danner dobbelthelix. Holdes sammen af hydrogenbindinger mellem baserne. G bindes til C, A bindes til T man siger kæderne er komplementære. Man kan altid udrenge hvilke basepar der sidder overfor.
Kan sammenlignes med snoet stige. Hver polynukleotid kan sammenlignes med en halv stige, vangen er den konstante del opbygget af skiftehvis deoxyribose og phosphat. Det halve trin er en af nukleinsyrerne.
3’- ende med fri OH-gruppe
5’-ende fri phosphatgruppe dette er en naturlig retningsangivelse da DNAsyntese aktid forgår fra 5’ -> 3’ at de to kæder er antiparalelle vil sige at deres 5’ og 3’ ender er modsat hinanden.
DNA denaturerer ved opvarmning Afkøles DNA-molekylerne igen vil de komplementære nukletidkæder igen finde sammen (renaturering). (udnyttes ved PCR...hybridisering).

DNA replikation
Kopi af DNA-molekylerne. Optakt til celledeling.
Specifikke proeiner bindes til replikationsstartedet, med til at opsno strengene.
DNA-polymerase laver de nye strenge. Den starter ved en primer (små stykker RNA) udden primer kan syntesen ikke foregå. Den ene streng laves som en lang streng ”the leading strand” mens strengene vikles fra hinanden. The lagging strand bliver (på grund af synteseretningen 5’ mod 3’) lavet som små DNA-stykker der efterfølgende bliver sat sammen til en sammenhængene streng ved at primerne fjernes, DNA-polymerase fylder hullerne ud og DNA-ligase ligerer/limer stykkerne sammen.
Telomerase. Enzym som kan tilføje nukleotider til 3’ enden af the lagging strand så det undgås at strengen bliver kortere og kortere for hver replikation. (primeren fjernes jo).
Hos mange organisme (bla. Mennesker) er kromosomerne forlænget. Tidligt i udviklingen og forsvinder gradvist igen. Kan sættes i forbindelse med aldring da man har set at når normale celler dyrkes kan de kun dele sig et vis antal gange før de går til grunde. Skyldes forkortelse af krosomernes telomer-ender.
Kræftceller har aktiv telomerase og bidrager til at cellerne er udødelige.

Kromosomer
Prokaryoters har et enkelt DNA-molekyle som er supercoiled så det kan være i cellen.
Protein-molekyler kan være løst bundet til DNA og derved hjælpe med at folde DNA sammen.
I eukaryotiske celler er de lineære DNA-molekyler pakket sammen i cellekernen ved hjælp af histoner, specielle proteiner der er positive og binder sig til de negativt ladede phosphatgrupper i DNA. Hovedtyper: H1, H2A, H2B, H3 og H4
Nukleosomer kerne af histoner med DNA snoet rundt om.
Histonkernen er en kuglestruktur med to af hver H2A, H2B, H3 og H4 omviklet med ca. 145 basepar DNA. H1 er linker-DNA bindet til DNA’et mellem nukleosomerne.
DNA+ histoner = kromotin. Ligner perler (nukleosomer) på en snor (linker-DNA)
Specielle regioner i kromatinet: SARs og MARs, normalt mellem de steder hvor selve generne sidder. Generne i kromatinløkker mellem fasthæftningstederne så transkriptionen kan foregå uhindret.
Centromer: den indsnørede del af kromosomet hvor søsterkromatiderne er fastjort under celledeling.

Heterokromatin forbliver tæt pakket, sandsynligvis altid inaktivt. Modsætning til eukromatin løsere pakket sammen, aktive gener her. Acetylering dvs. Påsætning af acetylgrupper til lysingrupperne i histonerne medfører at kromatinet får en løsere struktur og man kan se det hænger sammen med at genet bliver aktiveret.

Nogle transkriptionsfaktorer spiller en vigtig rolle i placeringen af knuleosomerne i og omkring et givent gen- de kan være med til at omplacere nukleosomerne så bindsstederne for transkriptionsfaktorerne bliver tilgængelige og kan genet aktiveres.

Transkription

Processen hvor DNA omskrives til RNA, altså hvordan gener udtrykkes eller aktiveres (kaldet genekspression).
Må mange måder ligner replikation og transkription hinanden: 5’ende til 3’ende, baserækkefølgen i den ene streng som skabelon...

Foregår både hos prokaryoter og eukaryoter ved at RNA-polymerase binder siger til en promoter (lige før et gen) kører igennem baserækkefølgen og aflæser den og danner RNA. Fortætter indtil den møder stopkode.

3 typer RNA: mRNA: transkripteres fra DNA og indeholder således koden til at danne et polypeptid. tRNA: et lille RNA molekyle som er med til at oversætte RNA til protein. En ende med aminosyrer og en der kan genkende baserækkefølgen i mRNA rRNA: ribosomal RNA.

Den DNA streng som har den samme basesekvens som RNA (bortset fra U har erstattet T) kaldes den kodende streng, selvom det i virkeligheden er den anden DNA streng der aflæses og pga. Baseparringsreglerne og synteseretningen fungerer som skabelon for dannelsen af RNA.

Kontrol af transkription – prokaryoter:
- Prokaryoter har kun én slags RNA polymerase der laver alle tre slags RNA
Gener der koder for enzymer der deltager i samme overordnede proces er ofte anbragt ved siden af hinanden så de på den måde kan transkripteres og kontrolleres sammen. Sådan en gruppe kaldes operon
f.eks. er det tilfældet med de enzymer der medvirker ved E.coli’s omsætning af lactose.

Operator lige efter promoter, hvis denne er bundet til et protein – repressor kan transkriptionen ikke forløbe. Repressoren fjernes med en inducer/activator som binder sig til repressoren. Induceren vil i E. Coli’s tilfælde kun dannes hvis der er lactose til stede. Hænger desuden også sammen med allosteriske enzymer (cAMP).
Andre enzymer komplekse forbindelser hvor operon er tændt indtil der er dannet tilstrækkelig mændge af produktet hvor efter den slukker. Enzymet er altså selv en slags repressor af transkriptionen. (feed back mekanisme?)

Kontrol af transkription hos eukaryoter: eukaryoter har tre typer RNA polymerase en til hver type RNA.

Transkriptionene af mRNA begynder med at RNA polymerase II binder sig til promoter umiddelbart før genet. Promoteren er kendetegnet ved at indeholde en eller flere sekvenser som RNA polymerease kan genkende. F.eks. en TATA-box med sekvensen TATAAAA, en GC-box med sekvensen GGGGCGGGGC eller en CAT-box med sekvensen CCAAT, et element placeret lige inden startstedet for transkriptionen, et initiator-element, eller et element efter startstedet for transkriptionen (nogle tilfælde).

Yderligere findes enhancer og silencer områder der kan hæmme eller øge transkriptionen. De kan regulere transkriptionen. De kan være anbragt før,efter eller i enkelte gener.

Både promoter, enhancer og silencer virker ved transkriptionsfaktorer bindes til dem enten direkte eller gennem en række andre proteiner og påvirker RNA-polymerasen.
To slags transkriptionsfaktorer: 1) de generelle: altid skal være tilstede, er i alle celletyper bringer RNA-polymerasen og promoteren sammen. De bestemmer start og retning af transkriptionen men kan kun transkribere små mængder RNA (det basale niveau) 2) de specifikke transkriptionsfaktorer der regulerer transkriptionsnivaeuet. Kun i visse celler hvor de skal styre udtrykket af bestemte gener. F.eks. hormonreceptorer i kernen der bindes til hormoner som kan diffundere ind både cellen og i cellekernen. Disse receptorer findes i promoter/enhancer områder på gener. receptorene binder sig til genet når hormonet er bundet til dem. Således aktiveres processen

eukaryotiske gener består af exons og introns. Exons er de kodende enkeltdele i DNA’et (eller mere præcist de dele af genet som ende i cytoplamsaet som del af færdigt mRNA. Ofte begynder translation et stykke inde i mRNA). Introns er de gener der ligger imellem exons og er ikke kodende.
Derfor skal eukaryotisk RNA trimmes før en translation således at RNA kun indeholder kodende exons.

Først dannes primære RNA-transkript: pre-mRNA. Det trimmes ved at de to ende ændres. I 5’enden sættes en 5’cap (beskytte RINA mod nedbrydning, og betydning for RNA og ribosomer kan finde hinanden).
I 3’enden sættes ved hjælp af poly(A)-merase en hale af A’er (længde afhænger af arten men mellem 100-250) ligeledes for at beskytte RNA mod nedbrydning og hjælpe ribosomer med at få fat i mRNA. Sidte trin i trimning er splicing hvor introns skæres ud og exons limes sammen

Translation

Forskel mellem pro og eukaryoter
Processen hvor et polypeptid dannes ud fra mRNA

Hos eukaryoter er transkription og translation to adskildte processer da eukaryoter har cellemembran. Det har prokaryoter ikke derfor kan translationen begynde inden transkriptionen er færdig.

Codons. Den genetiske kode, Triplet kode – tre baser svarer til en aminosyre.
Synonyme codons, mange codons koder for de samme aminosyrer
Koden er ikke fuldstændig universel. Undtagelser fundet i mitochondrier i mange organismer men også gener hos nogle få prokaryoter og eukaryoter.

tRNA - mRNA skal translateres – sker vha. tRNA - tRNA genkender både mRNA og aminosyrer (bestemte kombinationer af 3 baser) - Et tRNA molekyle er specifikt og genkender kun en slags aminosyre, Aminosyren bindes til den ene ende - Gruppen af enzymer, der hjælper med at binde de forskellige aminosyrer til deres respektive tRNA-molekyler, kaldes aminoacyl-tRNA-syntetaser - Den anden ende af tRNA-molekylet indeholder en tre-base sekvens, anticodon, der kan baseparres med det codon i mRNA, som passer til aminosyren i den anden ende af tRNA’et.
Ribosomer
- Bygget op af forskellige ribosomal RNA (rRNA-molekyler) samt flere end 50 forskellige proteiner til to store enheder, subunits - Stor subunit, lille subunit - Svedbergs ”S” – mål for, hvor hurtigt molekylet sedimentere (bundfældes) viser at eukaryotiske ribosom er 80S og prokaryotisk 70S. Eukaryotiske ribosomer er altså størst.

Initiering (translationsstar) - I både prokaryoter og eukaryoter findes 2 slags methionin-tRNA: tRNAiMet, der kan starte proteinsyntesen og tRNAMet, der kan indsætte methionin i en polypeptidkæde, der er igang med at blive lavet. - Den samme aminoacyl-tRNA-syntetase som før nævnt i Tranfer RNA, sætter methionin på tRNA i begge tilfælde - Men kun Met-tRNAiMet bindes til det specielle sted i den lille ribosomale subunit, hvor translationen kan begynde fra.
Prokayoter
mRNA bindestil et preinitieringskompleks, lille ribosomale subunit (30S) og proteiner der hedder initieringsfaktorer (IF’er) dette kompleks bindes til fMet-tRNAiMet som altså er startaminosyren Metionin med en formylgruppe (-CHO) og bundet til tRNA specifik for Met. Når komplekset og fMet-tRNAiMet bindes sammen kaldes det 30S initeringskompleks.
Komplekset finder startcodonet AUG i mRNA, ofte via en 8base sekvens i mRNA, Shine-Dalgarno sekvensen lige før et codon, som er komplementær til en sekvens i 3’enden af 16S rRNA som er en del af 30S subunit. Baseparingen melem disse to sekvenser hjælper til binding af ribosomet til mRNA.
Det endelige 70s IF dannes ved at det store ribosomebale subunit (50s) også bindes – energikrævende (GTP) proces.
Nu er translationen påbegyndt

Eukaryoter - preinitieringskompleks dannes ved lille subunit (40S) og IF’er. - Komplekset finder startcodon i mRNA. mRNA er trimmet og har derfor 5’cap struktur - 5’cap genkendes af proteiner som hjælper med at binde preinitieringskomplekset til mRNA - preinitieringskomplekset finder AUG og der dannes først et 40s initieringskompleks og derefter et endeligt 80S initieringskompleks omtrent som hos prokaryoter. - Der er ikke nødvendigvis den første AUG der er startstedet. Kozak-sekvens ACCAUGG syntes at være fortrukne .

Polypeptidforlængelse (elongering) - forskellig fra eukaryoter og prokaryoter men princip det samme: trinvis tilførsel af aminosyrer. - Også energikrævende - Specielle proteiner: elongeringsfaktorer (EF’er) - I ribosomet to bindingssteder aa-tRNAaa, P (peptidyl)- og A (aminoacyl)-stedet. - Efter korrekt start på translation er P-stedet besat af Met-tRNAiMet, der bundet til AUG i mRNA - Derefter bestemmer det næste codon i mRNA som findes på A-stedet i ribosomet, den næste aa-tRNAaa - Peptidyl transferase flytter Met fra dets tRNA i P-stedet til aminosyren i A-stedet og binder dem sammen med en peptidbinding. - Nu er der i P-stedet en tRNAaa uden sin aminosyre bundet men på A-stedet er et dipeptid der er bindet til en tRNA aa f.eks. kan det være Met-Arg- tRNAArg - Translokering: mRNA flyttes så dipeptidet der er bundet til A-stedet flyttes til P-stedet på ribosomet. Desuden er det næste codon i mRNA nu i A-stedet - P-stedets tRNAaa forlader således ribosomet of binder sig til en ny aminosyre. Der bindes til mRNA på A-stedet - processen fortsætter indstil stopkode. Termineringsfaktorer genkender stopkoden og er med til at frigøre de ribosomale subunits, mRNA og den sidste tRNAaa fra hinanden. - Et enkelt mRNA kan translateres af mange ribosomer samtidigt. De daner polyribosomer/polysomer.

Mutationer

kromosommutioner: - involverer mange gener

kromosommutiationer kan opdeles i to grupper 1) unormalt kromosomantal (numerisk afvigelser) 2) unormal kriomsomopbugning (strukturelle afvigelser)

generalt om begge: - konsekvenserne størst ved autosomer end kønskromosomer. Symptomer på autosomale afvigelser: mangelfuld intelligensudvikling, væksthæmning, misdannelser (især i hjertet) og sterillitet. Symptomer på kønskromosomafvigelser: forstyrrelse i kønsudvikling, ses oftes først i puberteten, normal intelligens. - Deletion (tab af kromosommateriale) er som regel mere alvorlig end dublikation (forøgelse)

numeriske afvigelser:

normalt: 46 kromosomer – 22 par autosomer 1 par kønskromosomer (diploide antal – 2n) kønscellerne indeholder 23 kromosomer (haploide antal) karyotypen – et menneskes kromosomsammensætning som kan ses i skema.

polyploidi
- mutiplum af de haploide antal og større en diploide kaldes (f.eks. triploidi – 3n). Et helt ekstra komosomsæt vil give et kromosomantal på 69 (3*23)
- to sædceller befrugter en ægcelle, eller fejl i meisoen hvorved der dannes diploide kønsceller
- spontan aborst eller nedsat levedygtighed hos nyfødte

aneuploidi aneuplodi ikke et multplum af det haploide antal. (f.eks. trisomi med 47 kromosomer – 2n +1)
Downs syndrom – tre udgaver af kromosom nr. 21. (trisomi)
Mongolsk ansigtstræk, typisk hjertefejl, mental retardering, muskelspænding nedsat, formindsket højdevækst

Kan ske ved non- disjunktion, hvor kromosomer ikke adskilles som normalt i meiosen. Nogle kønsceller vil altså indeholde for mange kromosomer andre for få. Mht trisomi-21- er fejlen i 95% af tilfældene opstået hos moderen. Risiko for fejl stiger med alderen.

Nondisjunktion i mitose – kan opstå under celledelinger når ægget er befrugtet og de efterfølgende celler vil have et unormalt kromosomantal. Individet får altså to typer celler: med normal og med unormal kromosomsammensætning. Det hedder mosaik

Turners syndrom (hyppigst fejl hos manden). Turner i 20% af tilfældende mosaik, og mildere grad.
Klinefelters syndrom og Turner er også resultat af non-disjunktion

strukturelle afvigelser:

translokation: overførsel af kromosomstykker mellem ikke homologe kromosomer hyppigeste fejl i struktur.

Kan opstå når der sker et brud å to kromosomer på samme tid.
Balanceret translokation: ingen tab eller tilførsel af genmateriale
Ubalanceret er den næsten altid sygdomsfremkaldene.
Centrisk translokation – en translokation hvor bruddene sker omkring centromererne.

Deletion: tab af kromosommteriale (eller blot tab af et basepar)
Ved kromosombrud eller skæv overkrydsning.
Overkrydsning er en normal del af meiosen hvor et (eller begge) kromatider krydser hen over kromatidet på det homologe kromosom, og der omstår et brud kromatiderne så disse kan bytte plads. Normalt er overkrydsningspunktet præcis det samme sted på de to homologe kromosomer. Men hvis ikke det er tilfælder er overkrydsningen skæv og der vil på det ene kromosom ske en dubplikation og det andet bliver afkortet med tab af genmateriale (deletion). Det foster der dannes ud fra kønscellen med deletionen kan blive født med svære misdannelser og mental retardering.

Duplikation: To kopier af en kromosomdel, sker typisk ved skæv overkrydsning. Mere almindelig end deletion og giver mildere symptomer.

Inversion: En del af kromosomet ved 180 grader. Stort set aldrig betydning men kan forstyrre overkrydsning og give deletion eller duplikation

Isokromosom: tab af ene kromosom arm og duplikation af den anden. En vandret deling af centromeret under celledelingen. Typisk hos piger med et X kromosom hvor den lange arm er duplikeret: monosomi mht X-kromosomets korte arm men trisomi mht. Kromosomets lange arm. Symptomer der minder om turners

Punktmutationer

Ændringer der opstår inden for et enkelt gen eller blot et enkelt basepar.
Dominante genner kan omdannes til recessive eller omvendt.

- Sker oftes spontant men kan skyldes visse stoffer f.eks. ioniseret stråling. - Sker oftes under replikationen hvor baserne parres forkert. - Hot spots: områder hvor mutationshyppigheden er større end normalt. Den normale mutationshyppighed er intervallet 109-1011 - Konsekvenser: o stum mutation: der sker ikke noget da mutationen bevirker at en triplet koder for den samme aminosyre som ellers. o Ændring af en aminosyre i et protein som bevirker at proteinet ikke virker korrekt. o Der bliver lavet en stopkode inde i polypeptidkæden – afkortet protein. Der sandsynligvis mister sin funktion. o Indsat eller fjernet en base: det kan også have alvorlige konsekvenser da læserammen den genetiske kode rykkes.

fragilt x-syndrom

- hyppigeste årsag til mentalt handicap - mutationer i et enkelt gen (FMR1) der ligger yderst på X-kromosomets lange arm. - Kan bevirke at stykket knækker af. - Gen udtryk protein : fragile mental retarding protein, der er knyttet til ribosomerne - Genet aktivt i alle væv men specielt i hjernen og tekstiklerne. - Sygdommen giver mentalretardering og hos mænd forstørrede tekstikler. - Sygdom fremkommer hvis en CGG-tripletkode er gentaget over 230 gange (fuldmuteret). - Når tripletten gentages ud over det normale (6-56 gange) bliver det ustabilt og har let ved at blive længere. Et spring fra præmuteret til fuldmuteret kan ske over en generation. - Det fuldmuterede gen dannet intet protein. - For kvinder: præmuteret gen særligt ustabilt. Til gengæld er sygdommen mildere da de har to X-kromosomer (og deres celler består af mosaik hvor henholdvis det ene og anden X er inaktiveret) - For mænd: fuldmuteret tilbagemuterer til præmuteret før sædcellerne færdigdannes. (dvs. Døtre af en syg far vil kun være bærer)

Muterede gener kan repareres

Der sker daglig mutationer f.eks. to thymin der bindes til hinanden (T-T dimer) eller cytosiner der mister NH2-grupper og bliver til uracil.

Heldigvis har kroppen enzymer til at reparere mutationerne.
Thymin-dimer: en endonuclease bryder DNA-stenget omkring dimeren og en exonuclease fjerner stykket med dimeren. Til sidst sætter DNA-polymerase et nyt stykke ind

C til U: reparation med uracil DNA glycosylase. Klipper omdannede base ud og resten af proceduren som T-T dimeren.

Mutagener: stoffer som kan forårsage mutationer.
f.eks. 5-bromuracil der kan sættes ind i stedet for thymin (en baseanalog) og danne par med guanin
A-T udskiftes med C-G

Klassisk Genetik – Nedarvning

Homologe kromosomer kromosomer der bærer gener der koder for en samme egenskab. De sidder på samme sted (locus) på hver kromosom. Et gen er knyttet til et bestemt locus på et kromosom
X og Y bærer ikke de samme gener. Y mindre end X
Alleler (allele gener) er to eller flere udgaver af det samme gen.
Recessiv – genet er vigende kommer ikke til udtryk hvis der er dominant gen
Dominant gen – kommer til udtryk hvis det er tilstede

Genotype –genetisk sammensætning af de to alleller. Aa, AA, aa.
Fænotype – genets virkning det man kan se.

Krydsningsskema:
Under meiosen adskilles de homologe kromosomer og den ene halvdel af kønscellerne vil indeholde den ene allel mens den anden halvdel indeholder den anden allel. Derfor kan deres afkom få 4 forskellige kombinationer.
AA og aa homozygot alleler er ens
Aa heterozygot
Rene linier = alle generationer er homozygoter

Parantalgeneration (P) forældregeneratioen
Første Filialgeneration (F1) afkommet af P

|Hun Aa |
|Han Aa |Aa |aa |
| |AA |Aa |

Analyse krydsning bruges til at udregne geno- og fænotyper for generationerne. Man ser altså på sandsynligheder og antager at individet f.eks. har genotype Aa og ser hvordan generne så nedarves.

Ufuldstændig dominans. Det dominante gen sklår ikke helt igennem selvom det er tilstede
Co-dominans. To dominante gener udtrykkes lige meget. F.eks. blodtypesystemet AB0 hvor en person med blodtype AB – genotype AB begge alleler A og B er udtrykt. En person med blodtype 0 har genotype 00 fordi 0 er ressisivt over for A og B. Det betyder at en person med blodtype A både kan have genotype AA og A0 ligeledes en med B kan have BB og B0

En person med blodtype A danner antistoffer i blodet imod blodtype B og omvendt
AB har hverken antistoffer mod blodtype A eller blodtype B og kan derfor teoretisk tåle transfusion med blod fra enhver AB0 blodtype.
Blodtype 0 har antistof mod begge

Kan være svært at skelne mellem ufuldstændig dominans og codominans i praksis

To gens nedarvning
f.eks. køer med allele gener for farve hvor sort S er dominant over rød s men også allele gener for farvefordeling hvor ensfarvet E dominerer broget e.
Man ser bare på to forskellige allele gener samtidig. Krydsningsskemaet bliver derfor lidt mere indviklet.
Forhold 9:3:3:1 i fæmotyperne med krydsning af heterozygoter men andre hvis der er tale om f.eks. co-dominans eller epistasi, hvis f.eks. udtrykket af allelparret b/b afhænger af allelparret A/a altså hvor to forskellige allelpar ved forskellige locus afhænger af hinanden.
| |SE |Se |sE |se |
|SE |SSEE |SSEe |SsEE |SsEe |
|Se |SSEe |SSee |SsEe |Ssee |
|sE |SsEE |SSEe |ssEE |ssEe |
|se |SsEe |Ssee |ssEe |ssee |

Denne fordeling kun tilfældet hvis genparrene sidder på hver deres kromsompar eller langt fra hinanden på samme kromsom. Hvis de sidder tæt sammen på samme kromosom er der tale om koblede gener

Koblede gener har tendens til at følge hinanden ved meiosen idet de er fysisk bundet til hinanden. Og ved overkrydsning er der større chance for at generne følges ad da de ligger tæt på hinanden end hvis de lå langt fra hinanden.

Kønsbunden nedarvning:
Nedarvning bundet til X eller Y kromosomet. Oftes X da det er størst.
Hos en mand vil et ressivt gen på X-kromosomet altid slå igennem fordi han kun har et X kromosom. F.eks. blødersygdommen. Dog er ikke alle egentskaber der oftes optræder hos det ene køn kønsbundet. for tidlig skaldethed er bundet til autosom, men optræder mest hos mænd da mandlige kønshormon medvirker.

Hos nogle dyr bliver kønnet ikke bestemt af tilstædeværelsen af y kromosomet. Nogle Fugle og krybdyr -> hunner XX hanner et X (X0)
Kønnet hos alligatore og krokodiller bestemmed ud fra den temperatur som ægget udlækkes under.

Polygen nedarvning. Mange gener invilverede kombinationer af fænotyper mange. F.eks. højde (men miljøet spiller også en rolle), hudfarve er baseret på mange genpar.

Ensvirkende – jo flere gener (A eller B eller C.....) jo mere bliver fænotypen udtrykt. De virker sammen med additiv effekt.

Kloning

Ordet klon kan både bruges på organisme niveau, men også på celle eller molekyler.
Organisme: organismerne er ens genetisk – enæggede tvillinger
Molekyllærbiologi: gruppe af identiske celler eller DNA.molekyler, der stammer fra samme celle elller oprindelige molekyle

Ukønnet formering er kloning

Kloning af dyr
Kun enæggede tvillinger er naturlige kloner når det gælde højt udviklede dyr.
Efterlignet i 70’erne ved at man delte et befrugtet æg på 2 og 4 cellestadiet.
De enkelte celler blev overført til rugmødre og udviklede sig til lam.
Begrænsning ved denne metode er at efter ganske få delinger i ægget er cellerne ikke længere i stand til at differentiere sig til alle celletyper. De er ikke længere totipotente.

Kernetransplantation
Her indfører man en cellekerne fra et andet individ till en ubefrugtet ægcelle der er klar til befrugtning men hvor cellekernen er fjernet. Den ubefrugtede ægcelle kan reprogrammere den nye DNA til at ligne DNA fra et befrugtet æg, den tænder og slukker for gener så den cellekerne bliver de samme som i en kerne i en normalt befrugtet ægcelle.
Det er blevet muligt at reprogrammere visse somatiske (krops) celler tilbage til at være totipotente for at udnytte dette til kloning. F.eks. dolly.

Kloning medfører etiske overvejelser. Er det okay at anvende kloningsteknikkerne og på hvem? (dyr mennesker....) men kloningsteknikkerne i sig selv kan også overskride en grænse.

Kloning kan blive brugt til masseproduktion af dyr til forsøg, studier af forskellige sygdomme, medicinske præparater.

Terapeutisk kloning
Udnytte kernetransplantation til at lave nyt væv eller organer
Riskoen for afstødning af nye væv vil formindskes betydeligt da det er dannet ud fra patienten selv.
Overordnet princip: 1. tager kropsceller fra patient. F.eks. fibroblaster (bindevævsceller) 2. indsætter cellekerner fra disse i ægcelle uden kerne. 3. Dannelse af nyt foster (eller egentlig embryon) så man kan få fat på embryonale stamceller som er totipotente 4. Få stamcellerne til at differentiere sig til det væv man har brug for. 5. Transplantering tilbage til patienten.
Igen etiske aspekter ved at danne et foster for at slå det ihjel.
Andre metoder (på tidlige forsøgstrin): a) Transdifferntiering: omprogrammere en celletype til en anden b) Stamceller fra kroppem (somatiske) isoleres og dyrkes så de differentierer til de ønskede celletyper c) Embryonal stamcelle lignende celler. Cellekernen fjernes fra disse og erstattes af patientens.
DNA kloning
Grundlæggende princip: insætter fremmed DNA i en kloningsvektor (DNA-molekyle) resultat er rekombinant DNA.molekyle der kan opformeres

Kloningsvektorer:
Plasmider: cikulæerr DNA-molekyler i baktierier og gærceller, som er adskilt fra deres kromosomale DNA. Bruges af baktierier til at overfører gener der koder for enzymer til at modvirke antibiotika – blive resistente. Plasmider duplikeres også ved celledeling. De kan desuden kopiere og overføres til andre bakterier.
Udnyttes til DNA kloning således: - bruger et finpudset plasmid, med resistent overfor et stof f.eks. ampcillin og med en sekvens som gør det kan replikere sig. - Pladsmid klippes med restriktionsenzym og DNA’et (ofte en gen) klippes med samme restriktionsencym så de passer sammen. - De limes sammen med DNA-ligase og man får en baktierietype til at optage det rekombinante plasmid. - Bakterierne gror i et vækstmedie med tilsat ampicillin således at celler der ikke er transformeret med plasmidet dør. Dem der er transformeret deler sig/vokser. bakterierne kan dog godt mangle det ønskede gen alligevel, selvom de har plasmidet. Kan ske at plasmidet limes sammen uden at genet er blevet indsat.
Man kan undersøge det ved at tilsætte plasmid en farvereaktion der kan være baseret på at plasmidet indeholder et farvegen der farver bakterien. Når så bruger resteriktionsenzymerne sørger man for de klipper det ønskede gen ind i farvegenet så det ødelægges. Klonerne i petriskålen vil derfor ikke være farvet (hvide)
Man kan også bruge PCR

Bakteriofager kan også anvendes som kloningsvektorer. Samme princip bortset fra at bakteriofager lyserer. Dvs. Spænges og inficerer andre bakterier.
Lyserede bakterieceller vil danne huller: plaques hvorfra man kan oprense det klonede gen med southern blotting hybridisering.
Man overfører alle plaques til et filtes som man hybridiserer med radioaktivt mærket DNA stykke der kun binder sig til det klonede gen. På røntgenfilm kan man se hvor de ”rigtige” kloner er. Bakteriofager bedst til klone DNA-størrelser på omkring 15-25000 bp
Plasmider er bedst til små, ca. 10-15000bp i nogle tilfælde 20.000 bp

Andre speciel designede kloningsvektorer: BAC (bacterial artificial chromosome), YAC (yeast artificial chromosome) kan bruges til DNA så stort som henholdsvis 300.000 og 1000.000 bp

Restriktionsenzymer
Enzymer der genkender og klipper specifikkke basesekvenser i det dobbeltstrengede DNA. De fleste genkender en palindromisk sekvens, en sekvens der er den samme læst forfra og bagfra men på hver sin streng. Man kan basepare et ønsket DNA stykke ind i plasmidet fordi at enderne vil passe sammen hvis de er klippet med samme enzym
Med fordel kan man når man klipper med restriktionsenzymer anvende to forskellige af disse. Så undgår man at det indsatte DNA kan indsættes i to retninger. Man undgår også at plasmidet kan selvligere altså sætte sig sammen uden DNA molekylet er med.
Det kan det jo ikke hvis der er anvendt to forskellige restriktionsenzymer, for enderne vil ikke passe.

Genmanipulerede dyr og planter

”Knock out” organismer: organismer hvor man har slået funktionen af et pågældende gen fra. Man ødelægger det oprindelige gen hos f.eks. mus for at se hvordan det virker. Der vil selvfølgelig være forskel på homo og heterozygote dyr. f.eks. hvis man slår begge alleler fra kan dyret måske dø men hvis kun en er slået fra kan det sagtens overleve. De ændrede gener nedarves på lige fod med organismens egne gener.
Transgene organismer. Organismer som er blevet modificeret så de indeholder et transgen, dvs et klonet gen som er blevet stabilt indsat i organismens egent DNA så det også nedarves ligesom alle andre gener i organismen. Ofte er transgenet fra en anden art.

De genmanipulerede dyr kan tjene som modeller for forskellige sygdomme f.eks. alzheimers, hungtington’s, kræft...
I biomedicin kan man også udnytte det. et transgent får med indsat menneske protein som blødere mangler vil kunne bruges til behandling da proteinet kan oprenses fra fårets mælk.

Planter tilført gener der gør dem resistente overfor ukrudtsmidler eller insekter.
Kan være risika.
Genmodficerede planter kan have inflydelse på det enkelte menneskes sundhed. Hvis man har tilført planten sundhedsskadelige forbindelser.

også for miljøet da de genmanipulerede planter kan udkonkurrene de oprindelige planter eller belaste miljøet mere end den oprindelige. miljøbelastning afhængig af faktorer som jord, vand- og luftforhold, også dyrene der lever i miljøet.
Brug af resistentgener som selektionsmarkører (f.eks det gen der gør plasmidet resistent overfor ampcillin) kan måske bevirker at der kommer flere resistente bakterier. Man udvikler teknikker der fjerner markørerne igen.

Genterapi

Behandling hvor man ændre på et individs arvemeteriale. Man skelner mellem behandling af kropsceller og kønsceller. Sidstnævntef orbudt i mange lande. Blandt andet dk

Bruger virus som vektor
Erstatter nogle virusgener i f.eks. adenovirus (forkølelese) eller retrovirus med et terapeutisk gen og lader virus inficere de relevante celler hvori det klonede terapeutiske gen gerne skulle virke.

Problemer: - forsøg med at kurere cystisk fibrose - det indførte gen holde op at virke efter et par uger og den samme virus kan ikke genbruges da kroppen har opbygget immunitet. Selve genterapien kan forårsage betændelse i lungerne

- man må have identificeret og klonet genet der er årsag til sygdommen - ramme de rigtige celler er et problem. Designe en vektor for hver celletype og sygdom - hvor mange celler skal inficeres før behandlingen virker - hvordan skal genudtrykket være og hvordan kontrollere man det. - hvordan undgår man at der i patientens celler ud fra de injicerede virus-vektorer kan dannes virus, der kan replikere sig selv og spredes i kroppen.

Kortlægning af menneskets gener:

1. Oprense DNA fra celler 2. Klippe DNA med restriktionsenzymer 3. DNA fragmenter indsættes i plasmider der udgør et DNA bibliotek og repræsenterer alt DNA i den organisme hvorfra cellerne stammede.

I praksis har man anvendt BAC-vektorer der kan indeholde 300.000 basepar og dermed indeholde mindst 10^4 kloner for t dække hele genomet.

Man regner med at menneskets DNA består af 3-5% kodende exons og mere end 95% ikke kodende introns

Menneskelige genom kortlagt dvs. Base-rækkefølgen af DNA af alle vores kromosomer er kendt. Men det betyder ikke at vi kender alle gener for det er ikke indlysende hvad der er exons og introns. Man kan bruge RNA til at identificere om det er exons eller introns da RNA trimmes (fjernelse af introns).

revers transkriptase et enzym kendt fra retrovirus. Enzymet er en polymerase der kan danne DNA fra RNA.( Nødvendig for retrovirus da denne omdanner dens RNA-genom til DNA der insættes i værstcellens genom)

men revers transkriptase kan man opsamle alle mRNA molekyler i en celletype og transkriptere dem tilbage til DNA. Men det vil være cDNA (complementary DNA) der er komplementært til DNA og kun indeholder exons.

cDNA bibliotek for de pågældene celletyper med klonet cDNA molekyler i plasmider. cDNA bibliotekker er både celle og organisme specifikke de repræsenterer gener der udtrukkes og der udtrykkes langt fra de samme gener i alle celletyper i en organisme. gDNA – genomisk DNA indeholder alt DNA og er altså ikke specifikt for celletyper.

Selvom man har et cDNA bibliotek ved man alligevel ikke hvad hvert gens funktion er. Man kan finde ud af hvilken protein det danner,¨, men det siger ikke nødvendigvis noget om proteinets rolle i cellen. Desuden kan et gen blot kode for en del af et protein.

Når an har kortlagt menneskets gener kan man derimod godt undersøge et enkelt individ og se om denne person har en kendt eller ukendt mutation.

Håber på at kunne lave medicin der doseres individuelt ud fra den individuelle genetiske profil.

Genetiske arbejds- og analysemetoder

Gelektroforese
Elektroforese er en teknik man bruger til at adskille og analysere molekyler i en blanding. Princippet er at forskellige molekyler bevæger sig forskelligt i et elektrisk felt, afhængigt af molekylets form, ladning og størrelse. Til elektroforese af DNA, RNA eller proteiner bruger man geler; en halvfast opløsning med en konsistens som gelé. Hvad man laver gelen af afhænger af hvad man ønsker at adskille

Gelelektroforese af proteiner:
Gel-elektroforese af proteiner sker i polyakrylamidgeler. Disse geler er lavet ved at stivne akrylamid mellem to glasplader. Når man så tilsætter sin proteinblanding til polyakrylamidgelen og lader en strøm løbe igennem den vil proteinerne vandre igennem gelen. Hastigheden afhænger af strømstyrken og gelens ”pore-størrelse”. Hvordan de vandre afhænger af deres ladning, størrelse og form.
Man behandler tit polyakrylamidgeler med SDS (sodium dodecylsulfat), som denaturer proteiner. De kan adskille polypeptidkæder til enkelte polypeptider. De enkelte polypeptider vil få ens ladning og masse forhold, da den dækkes af negativt ladet SDS-molekyler.
Nu, er forskelle i form og ladning elemineret og det er kun længden af polypeptidet der bestemmer vandringshastigheden i gelen. Hvis man i en sådan gel kører polypeptider hvor størrelsen er kendt. Kan man ved at sammenligne få et godt mål for størrelserne i de ukendte proteiner.

Todimensional gel-elektroforese

Den todimensionale gel-elektroforese, bygger på samme grundprincip, nemlig at adskille og analysere proteiner fra en blanding. Fordelen ved denne elekrroforese, er at man kan adskille proteiner som umiddelbart har en størrelsesforskel på >5 – 10 %.

Ved den todimensionale elektroforese, starter man med at gøre præcis det samme som man gjorde i den alm. gel-elektroforese, nemlig at adskille proteinerne vha. deres positive og negative ladninger. Så har man dannet en pH gradient bestående af et elektrisk felt, med henholdsvis kationer (positive) og anioner (negative). Derefter lader man bladningen af proteiner, flyder gennem pH gradienten og på den måde vil proteinerne ligge sig efter deres pH-værdi. Proteinerne vil placere sig på deres pH, hvor deres nettoladning er 0 (dette kalder man for isoelektrisk fokusering, IEF). Denne metode er så effektiv at man kan skelne mellem proteiner, helt ned til en enkelt ladningsenhed. Derpå sætter man IEF-gelen ved SDS-gel (poly mættet akrylamid-gel), og lader elektrisk strøm igennem. Dermed vil proteinerne placere sig efter størrelse, og man kan adskille og analysere dem.

Teknikken foregår altså med to hovedpunkter, - først at fordele proteinerne efter deres ladning, IEF, og step to er at lade proteinerne fordele sig efter størrelse på en SDS-gel.

Gel-elektroforese af nukleinsyre

DNA og RNA molekyler kan adskilles og størrelsesbestemmes vha. gel-elektroforese (ligesom proteiner). – Et klonet stykke DNA kan adskilles fra plasmid-DNA, ved at klippe med det samme restriktionsenzym.

Derefter analyseres DNA-blandingen ved Gel-elektroforese. Plasmid-DNA og det klonede DNA køre gennem gelen med en hastighed svarende til den. (og derfor vil man i elektroforese se to bånd.

Når man adskiller nukleinsyrer, kan man enten bruge polyakrylamid-geler eller agarose-geler. Agarose-geler, som består af agarose der kommer fra tang. Fordelen ved agar, som er det geledannende stof fra tang er, at den smelter ved høj temperatur, således man kan hælde det ned i en støbe-form, hvormed agar ved afkøling bliver til den gelé, man ønsker.
Til små DNA-molekyler bruger man næsten altid polyakrylamid-geler, hvorimod ved DNA-molekyler der strækker sig fra ca. 200 bp til ca. 20.000 bp, bruger man agarose-geler.

For at fremkalde et billede af de enkelte DNA-bånd efter en gel-kørsel, kan man benytte forskellige metoder. De mest anvendte metoder er farvning med et stof eller radioaktivt mærkning af DNA.

Ved favning med et stof, benytter man stoffet ethidium-bromid (EtBr), som binder sig imellem DNA-strengene. Ved dermed at behandle gelen med EtBr og dernæst belyse den med ultraviolet lys, kan man se de enkelte DNA-bånd. Men sådan et stof, der kan binde sig til DNA, gør det samtidig til et kræftfremkaldende stof, som derfor skal benyttes varsomt.

Hvis man radioaktivt mærker DNA i gelen, kan man efter gelkørslen lægge en røntgenfilm på gelen og man lader filmen eksponere. Når man så fremkalder den såkaldte film, vil man se mørke bånd, som svarer til de radioaktivt mærkede bånd.

Sekvens bestemmelse af DNA

Bestemme nøjagtig baserækkefølge i et DNA
Sanger metoden:
Adskille de to strenge i DNA-stykket (f.eks. et plasmid eller et PCR fragment)
Adskillelse ved opvarmning så det denaturerer.
Tilsætter primer – kunstig lavet DNA på 15-25 nukleotider. Stykket er komplementær til et stykke af det DNA man vil sekvensbestemme, det kan basepare med det DNA man vil bestemme.
Tilføre DNA-polymerase og de 4 baser efterligner man DNA replikationen

Laver DNA-syntesen i 4 rør hvor man tilsætter normale nukleotider også tilsætter radioaktivt mærkede. Hvert rør tilsættes desuden en lille konc. af de fire dideoxy-nukleotider (ddGTP, ddATP, ddCTP, ddTTP) nukleotider uden 3’OH-gruppen som ellers er nødvendig for at nukelotiderne kan kobles sammen.
Når der indbygges er ddNTP i stedet for dNTP stopper reaktionen.
Resulatet bliver et rør med en blanding af DNA-stykker af alle mulige længde svarende til alle positioner af basen i det DNA der bliver lavet i røret.

Man stopper altså reaktionen ved hver enkelt af de fire rør og til sidst køres resultatet af alle rør på en polyakrylamid-gel. Som adskiller DNA-længder der varierer med blot en base. Da de er radioaktivt mærkede vil man ved fremkaldeldse få et billede af alle de forskellige DNA-stykker lavet i de fire reaktioner og direkte aflæse sekvensen fra dette billede.

Denne metode gøres autmatisk med computer, detektor og laser. Man bruger kun et rør hvor her ddNTP er mærket med en fluorescerende farve.

PCR

PCR-reaktionen: der bliver lavet mange kopier af det gen eller DNA-stykker men er intereserret i, en så stor mængde, at det også kan undersøges yderlige vha. andre metoder. Fx sekventering eller Southern blotting analyser.
For at benytte sig at denne metode, behøver man på forhånd at kende en kort DNA-sekvens i hver ende af det DNA-stykke, der skal amplificeres (laves kopier af).
Ud fra disse sekvenser kan der laves en primer til hver ende, og der kan vha. disse + en specifik DNA-polymerase (der kan tåle høje temperaturer) + baserne Adenin, Thymin, Guacin og Cytosin foregå en PCR-reaktion.

PCR-Metoden:

1: Denaturering 93-95 grader:
Adskillelse af de to strenge i DNA molekylet.

2: Hybridisering 40-68 grader:
Primerne binder sig til DNA ved hjælp af baseparringsreglerne (A-T og C-G)

3: Polymerisering 70-74 grader:
Speciel DNA-polymerase, som kan tåle høje temperaturer, forlænger DNA fra primeren (indsætter nukleotiderne ved hjælp af baseparringsreglerne.

Southern blotting

Southern blotting er en analyse, som bruges til at analysere et ukendt DNA stykke. Grundideen ved denne analyse er hybridisering. Kort fortalt, er hybridisering det, at lade 2 DNA-strenge med komplementære sekvenser (de passer sammen) baseparre med hinanden. Når man undersøger et stykke ukendt DNA, kan man undersøge om dette stykke er bevaret i andre organismer, ved hjælp af hybridiseringen. Teknikken kan bl.a. anvendes fylogeni, der fortæller hvordan og hvor tæt de forskellige arter er beslægtet. 1. to DNA stykker skal sammenlignes 2. klipper dem med restriktionsenzymer 3. med gelelektroforese sortes de afklippede stykker efter størrelse 4. med en basisk opløsning adskilles DNA-stykkerne i gelen 5. tager aftryk på filter 6. DNA-stykke man vil undersøge mærkes radioaktivt og gøres enkeltstrenget kaldes probe 7. Filter og probe anbringes i opløsning – hybridisering hvis proben baseparer med filteret tyder det på den er identisk med DNAstykker fra filteret altså den sekvensen er opbevaret mellem de respektive arter 8. For at undersøge hvilke stykke proben har pasebarret med – røntgenfilm så man kan se et mørkt bånd (radioaktiv mærkning) hvor parringen har fundet sted

Northern Blotting:

bruges til at genkende RNA-sekvenser.
Man bruger samme metode som SB-metoden.
I Northern Blotting analysere RNA-molekyler, ved gelelektroforese før man overfører det til filtret.
Man kan finde ud af hvor meget, hvor og hvornår et gen kommer til udtryk.

- man tager RNA fra noget væv. - Ligger det på hver sin bane af gel - Man overfører det til filtret - Filtret hybridiseres med et radioaktivt probe (oftes et cDNA) - Fremkalder et røntgen billede af det = et mørkt bånd kommer til syne. - RNA-molekyler har hybridiseret med DNA proben

Nogle gen kommer mere til udtryk end andre. – dette kommer an på hvad genet koder for og hvor det er. Det viser hvor stor mRNA’et er.
Hvis genet er lyst er der meget lidt af genet, hvis båndet er meget mørk er der meget af genet.