TALLER 3. EXTRACCIÓN DE PROTEINAS
Preguntas teóricas 1. Proceso para la extracción de proteínas: Precipitación salina o salado con Sulfato de Amonio

a) El primer paso a seguir para un proceso de extracción de proteínas es la lisis o rotura celular, en la cual, se ‘destruyen’ los bordes celulares (membrana plasmática y/o pared celular según el caso) para así permitir la liberación de las proteínas de interés, sin ninguna modificación molecular, evitando efectos secundarios por degradación térmica o proteólisis, entre otros (Universidad Nacional de Quilmes, 2009). Para lo anterior, y según las características del tejido u organismo de estudio existen varias técnicas como * Lisis celular: consiste en suspender las células en una solución hipotónica para inducir la entrada de agua a ellas (presión osmótica) causando su hinchamiento y rotura. Este procedimiento es válido para células sin pared celular (Universidad Nacional de Quilmes, 2009). * Homogenización: es un proceso de destrucción mecánica, el cual puede inducirse por medio de una licuadora o un homogenizador, que generan un cambio brusco de presión y como consecuencia se ‘rompe’ la célula (ITESCAM, 2010). * Ciclos de congelación: la rotura se da por cambios bruscos de temperatura a los que se somete la muestra celular (ITESCAM, 2010). b) Luego de la lisis, se procede a la separación de los diferentes componentes celulares, esto se puede llevar a cabo por medio de centrifugación diferencial (10 000-15 000 rpm). En este apartado, las proteínas de membrana quedarán en el fondo del centrifugado y en el sobrenadante, quedarán otras proteínas solubles; estas últimas serán las proteínas de interés (ITESCAM, 2010). c) Una vez separado el sobrenadante, este se someterá a la técnica de precipitación con Sulfato de amonio. Esta sal es muy soluble en agua a temperatura ambiente (760g/1L a 20°C) y es adecuada para generar la precipitación proteica, ya que el ión sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas iónicas en el medio (Espinel, n.d.). Es importante resaltar, que entre los factores que alteran la solubilidad de las proteínas se encuentran la temperatura, el pH del medio y la fuerza iónica. Esta última, es el fundamento de este proceso de extracción; en general, las proteínas requieren de un medio salino para entrar en solución (fenómeno de “salting-in”) y pueden ser precipitadas a altas concentraciones de sal (“salting-out”) (Espinel, n.d.).
Las proteínas en solución, interactúan con el agua a través de puentes de hidrógeno, debido a la presencia de grupos polares en sus aminoácidos. De esta manera, cuando se adicionan altas concentraciones de iones muy cargados, estos aumentan la fuerza iónica del medio y disminuyen las interacciones de las proteínas con el agua, ya que se disminuye en medio de solvatación (menos moléculas de H2O disponibles para la interacción). Por lo anterior, las interacciones proteína-proteína son predominantes ante las interacciones agua-proteína y es así como ocurre la precipitación (IIB (Instituto de Investigación Biológica Argentino), 2011).

2. Estudio molecular de proteínas

El premio nobel de química en el 2002, Kurt Wüthrich, desarrolló una técnica de resonancia magnética nuclear (RMN) (la misma que se utiliza en medicina) (La Nación, 2002), con el objetivo de tomar imágenes de proteínas tridimensionales en solución. Esta técnica, permite investigar la molécula en su posición original, por esto, contribuye a identificar la ubicación en el espacio de todos los átomos que la componen, además de su movilidad (SDH , 2000). Esta técnica se fundamenta en un fenómeno físico-cuántico donde se aprovecha el momento angular y magnético de cada núcleo presente en los átomos que componen la proteína. Este científico, junto con otros, desarrolló algunos métodos precisos para identificar las proteínas más importantes dentro de una célula. Para esto, implementaron la técnica de electroforesis en donde se separan las moléculas por su movilidad en un campo eléctrico. Esta última característica es de las más importantes en el desarrollo de esta técnica ya que no muchas permiten hacerlo y es fundamental para posteriormente analizar el funcionamiento de la molécula y su aplicación, por ejemplo en el desarrollo de nuevos fármacos (Hornak, 1996).
Kurt Wüthrich es autor de más de 600 artículos científicos unos de los más conocidos son: * RMN en Investigación Biológica: Péptidos y Proteínas, North Holland, Amsterdam, 1976 * RMN de Proteínas y Ácidos Nucleicos, Wiley, New York, 1986 * RMN en Biología Estructural, World Scientific, Singapore, 1995

3. Importancia biológica y evolutiva de las proteínas
El estudio del proteoma, es decir del conjunto de todas las proteínas que conforman un organismo, es de gran relevancia biológica ya que por medio de este es posible comprender, no solamente la estructura de las proteinas, sino también cómo la secuencia de amino ácidos determina su función específica. A nivel biológico las proteínas se encargan de un sinfín de procesos, entre ellos identificación, defensa, movimiento y señalización celular. Es por esto, que entender su funcionamiento puede ser clave para detectar algún caso de patofisiológico. Por otro lado, lograr descifrar la totalidad de las cadenas protéicas que componen a un organismo, y ponerlas en conjunto con su genoma, permite entender, entre otras cosas, de qué manera se ha logrado una diferenciación marcada entre especies. Por lo anterior, el estudio de las proteínas también es importante para comprender procesos evolutivos en el tiempo (ITESCAM, 2010).
Preguntas de la práctica 1. Materiales y métodos (Diagrama de flujo).

2. El SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) es un detergente, que por su carácter anfipático puede adherirse a la membrana celular, de esta manera, por medio de interacciones hidrofóbicas contribuye a la lisis de las células. Su función en este proceso es, además de facilitar el rompimiento de la membrana para la extracción de proteínas del interior de la célula, participar en la denaturación de las proteínas. De esta manera, se garantiza en el proceso de extracción obtener las proteínas en su estructura primaria y cargadas negativamente.
3. Como lo que se busca con la práctica es obtener las estructuras primarias de las proteínas, al calentar las muestras se logra romper los enlaces disulfuro que las mantienen en su estructura terciaria y otro tipo de interacciones químicas existentes, como los puentes de hidrogeno, fuerzas de Van Der Waals e interacciones hidrofóbicas.
a) Si no se controla la temperatura a la cual están las muestras durante el calentamiento, se podrían llegar a perder las proteínas; esto debido a que se alcanzaría un grado muy alto de denaturación y se romperían los enlaces pépticos que mantienen a la proteína en su estructura primaria.

b) Otro método que cumpla con la misma función de la temperatura en el proceso de denaturación, sería cambiar el pH de la muestra alejándolo suficientemente del punto isoeléctrico de las proteínas (ya sea acidificando o alcalinizando). De esta manera, se lograría alterar las cargas nativas de las biomoléculas, lo cual contribuiría a la denaturación de las proteínas.
Bibliografía
* Espinel, L. F. (n.d.). Aislamiento de proteínas. Informally published manuscript, Química, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia. * Hornak, J. P. (1996, Septiembre). The basics of MRI. Recuperado el 5 de Febrero de 2013 de http://www.cis.rit.edu/htbooks/mri/inside.htm * IIB (Instituto de Investigación Biológica Argentino). (2011, Febrero). Técnicas de laboratorio. Recuperado el 4 de Febrero de 2013 http://www.iib.org.ar/bajar_material.php?archivo=87.pdf * ITESCAM. (2010, Agosto). Tema6.purificaciÓn de proteínas. Recuperado el 5 de Febrero del 2013 de http://www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r46007.PDF * La Nación. (2002, Octubre 11). Noble de química. Recuperado el 5 de Febrero de 2013 de http://axxon.com.ar/not/119/c-119infonobelquimica.htm * SDH (2000, Abril). Biografía Kurt Wüthrich. Recuperado el 5 de Febrero de 2013 de http://www.mcnbiografias.com/app-bio/do/show?key=wuthrich-kurt * Universidad Nacional de Quilmes. (2009, Marzo). Tp2: Extracción y cuantificación de proteínas. Recuperado el 4 de Febrero de 2013 de http://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp2.pdf