Генетската технологија овозможува да се менуваат растенијата за да се одговори на барањата на земјоделието, исхраната и индустријата

Во изминатите години сме сведоци на на спектакуларни откритија во генетската технологија на растенијата. Во 1984 година, групата на Марк ван Монтагју и Џеф Шел во Гент и Келн, како и групата на Роберт Хорш со соработниците од компанијата Монсанто во Сент Луис, во американската сојузна држава Мисури, истовремено објавија процедури за пренос на туѓа ДНК во геномот на растенијата, со користење на Ti плазмидите на Agrobacterium tumeficiens (во новата номенклатура Rizobium radiobacter). Овој метод овозможува специфично да да се менува составот на протеинот во растенијата, за да се одговори на специфични барања: на пример, да се направат растенијата отпорни на штетници или хербициди, да се постигне квалитативно или квантитативно подобрување во продукривноста на растенијата и да се прилагодуваат растенијата така што можат да произведат одредени суровини за хемската индустрија. Речиси ниту едно откритие во ботаниката немало такви далекусежни последици за талку кратко време, ако се има предвид дека во САД во 2003 година околу 80 % од сојата, 70 % од памукот и 38 % од пченката биле видови изменети со генетски инженеринг со користење на Agrobacterium tumeficiens. Тука имаме случај во кој резулатите од основи истражувања на егзотична тема доведе до техника која доведе до револуција во земјоделието. Во текстот ќе објасниме како растението може да се менува со генетски инженеринг. Од големиот број воспоставени процедури, овде можат да се опишат само принципите на некои од главните методи. Заради обемноста, деталите во методите ќе бидат изоставени. Со некои практични примери ќе се обидеме да покажеме како генетскиот инженеринг може да се користи за менување на растенијата.

1. Изолација на генот Да разгледаме случај кога треба да се добие трансгенско растение А, во кое се синтетизира туѓ протеин (на пр. протеин од друго растение Б). За ова, генот кој го кодира соодветниот протеин право треба да се изолира од растението Б. Бидејќи едно растение содржи помеѓу 25.000 и 50.000 структурни гени, ќе биде тешко да се изолира еден ген од овој огромен број.

За изолација на генот е потреба библиотека на гени За да се изолира одреден ген од големиот број гени што постојат во геномот на растението, препорачливо е овие гени да се имаат на располагање во вид на библиотека на гени. Можат да се изработат два вида на генетски библиотеки. За да се изготви библиотека на геномска ДНК, вкупниот геном на организмот се пресекува со рестриктивни ендонуклеази на фрагменти од околу 15 до неколку 100 kbp. Дигестијата на геномот на овој начин резултира со многу голем број ДНК секвенци, кои често содржат само делови од гени. Овие фрагменти се ставаат во вектор (на пр. плазмиид или бактериофаг) и тогаш секој фрагмент се засилува со клонирање, вообичаено во бактерија. За да се изготви cDNA библиотека, прво се изолираат mRNA молекулите присутни во специфично ткиво, а потоа се транскрибираат во соодветната cDNA преку реверзна транскриптаза. cDNA се става во вектор и се амплифицира со со клонирање. mRNA се изолира од ткивото во кое соодветниот ген е изразен во висок степен. За разлика од фрагментите во геномската библиотека, резултирачките cDNA содржат цели гени без интрони и поради тоа можат, по трансформацијата да бидат изразени во прокариоти за да синтетизираат протеини. Бидејќи cDNA не содржи промотерски региони, за ваквото изразување е потребен прокариотски промотер да се додаде на cDNA. За да се изработи cDNA библиотека од ткиво на лист, на пример, вкупната РНК се изолира од листовите, и од неа може да има само 2% mRNA. За да се оддели mRNA од голем број други РНК видови, се користи фактот дека еукариотската mRNA содржи поли (А) опашка на 3' терминусот. (сл.20.8). Ова овозможува mRNA да се оддели од останатите РНК афинитетна хроматографија. Материјалот во колоната се состои од цврсти делови целулоза или друг материјал со кој се поврзува поли-деокситимидин олигонуклеотидот [poly-(dT)]. Кога РНК мешавината екстрахирана од листовите се стави во колоната, mRNA молекулите се врзуваат за колоната преку хибридизација на својата поли (А) опашка со poly-(dT) од материјалот во колоната, при што [pic] Слика 22.1 Сепарација на mRNA од мешавина на РНК преку поврзување на poly-(dT) секвенците кои се поврзани со честичките. [pic] Слика 22.2 Транскрипција на mRNA во двојно верижна cDNA.

другите РНК поминуваат (Слика 22.1) Со соодветен бафер врзаната mRNA поминува низ колоната. За да се синтетизира преку реверзна транскриптаза, cDNA нишка комплементарна на mRNA, како прајмер се користи poly-(dT) (Слика 22.2). Следствено, mRNA се хидролизира со рибонуклеаза, било целосно, или, како што е прикажано на сликата, само делумно. Второто има предност бидејќи фрагментите од mRNA можат да служат како прајмери за синтеза на втората cDNA нишка со ДНК полимераза. Со користење на ДНК полимераза I, овие фрагменти на mRNA сукцесивно се заменуваат со ДНК фрагменти и тие се поврзуваат еден со друг преку ДНК лигаза. [pic] Слика 22.3 Внесување на cDNA во λ-phage вметнувачки вектор

Краток дел од РНК останува, и тој не се заменува на крајот на втората cDNA нишка, но ова нема голема важност, бидејќи во најголемиот број случаи mRNA на 5' терминусот содржи некодирачки регион. (види слика 20.8). Двојно верижните cDNA молекули што така се формираат од mRNA молекулите се амплифицираат со клонирање. Плазмидите и бактериофагите можат да се користат како вектори за клонирање. Постои разлика меѓу векторите кои само ја амплифицираат ДНК и вектори за експресија со кои можат исто така да бидат синтетизирани протеините кодирани со амплифицираните гени.

Библиотеката на гени може да се чува во фаги Сликата 22.3 го покажува вметнувањето на cDNA во ДНК на λ phage. Во прикажаниот пример phage ДНК поседува место за сечење за рестриктивната ендонуклеаза EcoRI. За да се заштитат рестриктивните места во cDNA, двојната верига на cDNA прво се метилира со EcoRI метилазата на местата за рестрикција на EcoRI. ДНК лигазата потоа се ористи за да ги поврзе хемиски синтетизираните двојно верижни олигинуклеотиди со вградено место за рестрикција (во овој случај за EcoRI) со двата краја на двојно верижната cDNA. Овие олигонуклеотиди се нарекуваат поврзувачи. [pic] Слика 22.4 Рекомбинантна phage ДНК се вметнува во вирусна честичка. Клетките од E.coli се инфицираат со формираната phage и се ставаат во плочки со агар. Клетките од инфицираните колонии се покажуваат како транспарентни точки

Рестриктивната ендонуклеаза EcoRI го сече овој поврзувач како и λ phage ДНК и така создава лепливи краеви на кои комплементарните бази од cDNA и phage ДНК можат да се анилираат со базно впарување. Веригите на ДНК потоа се поврзуваат со ДНК лигазата и на тој начин cDNA се вметнува во векторот. Phage ДНК со вметнатата cDNA се става in vitro во phage протеинска обвивка. (Слика 22..4), со користење на екстракт за пакување од бактериите инфицирани со phage. На овој начин се добива библиотека на гени, во која cDNA формирана од многуте различни mRNA на ткивото на листот се спакувани во phage, кои по инфицирањето на бактеријата, моѓат да се амплифицираат ad libitum, при што секоја спакувана cDNA формира клон. Бактериите се инфицираат со тоа што се мешаат со phages и потоа се ставаат на агар плочки кои содржат медиум за култивирање. На почетокот инфицираните бактерии растат на агар плочките, а потоа се поврзуваат со phages кои се размножени во бактеријата. Колониите бактерии се појавуваат на агар плочките како јасни точки наречени plagues. Тие содржат ново формирани phages, кои можат да се размножуваат понатаму. Вообичаено е една cDNA библиотека да се постави на 10 до 20 агар плочки. Идеално, секоја од нив содржи само еден клон. Клонот кој ја содржи cDNA од бараниот ген се избира со користење на специфични проби како што е опишано подолу. [pic] Слика 22.5 cDNA може да се пропагира преку плазмиден вектор во E.coli. Ген за отпорност на антибиотици на плазмидот ја овозможува селекцијата на трансформираните клетки.

Библиотеката за гени може исто така да се чува во плазмиди

За да се клонира библиотека на гени во плазмиди, cDNA се вметнува во палзмидите преку место за рестрикционо сечење на повеќе или помалку истиот начин како и вметнувањето во Трансферот се прави со третирање на клетките со CaCl2 за нивната мембрана да се направи попропусна за плазмидот. Клетките потоа се мешаат со плазмидна ДНК и се изложуваат на краток топлотен шок. Плазмидниот вектор содржи ген за отпорност на антибиотоци, кој бактериите ги прави отпорни на одреден антибиотик, како ампицилин или тетрациклин. Кога соодветниот антибиотик се додаде во културата, клетките кои го содржат плазмидот преживуваат и растат, додека оние нетрансформираните клетки умираат. По нанесувањето на агар култура, колониите со бактерии се развиваат, ри што можат да се препознаат како точки. За да се провери дали плазмидот всушност содржи вметната ДНК секвенца (уметок) направени се плазмидни вектори во кои местото за рестриктивно сечење за вметнување на туѓата ДНК е лоцирано внатре во генот, кој го енкодира ензимот β-галаксозидаза. (Слика 22.6). Овој ензим го хидролизира безбојното соединение Х-Gal во нерастворлив син производ. Кога X-Gal се додава во медиумот на агар плочката, сите клонови што не содржат вметната ДНК и со тоа содржат недопрен ген на β-галактозидаза, создаваат сини колонии. Доколку сегментот од ДНК е вметнат на местото за сечење на генот на β-галактозидазата, ово ген е прекинат и не може повеќе да кодира функционална β-галактозидаза. Поради тоа соодветните колонии не се обојуваат сино туку остануват бели (сино/бела селекција)

[pic] Слика 22.6 За да се провери дали плазмидот од бактериската колонија содржи ДНК уметок, местото за сечење на плазмидниот вектор е задржано во ген од β-галактозадаза. Во колониите со недопрен ген (без уметок) безбојната хемикалија X-Gal се хидролизира со соодветниот ген и индоксил дериват кој оксидира за да формира сино обоен димер. Ова резултира со сино обојување на колонијата. Кога функцијата на генот на β-галактозидазатае прекинатасо ДНК уметок, генетскиот производ повеќе не може да се формира и соодветните колонии не се обојуваат сино.

Библиотеката на гени се пребарува за одреден ген За пребарување на бактериските колонии или phage плочките се користат специфични проби за одредениот ген. Врз различните агар плочки се става најлонска или нитроцелулозна мембрана (слика 22.7). Некои од phages кои се содржат во плочките или бактериите што се содржат во колониите се врзуваат со мембраната, иако најголемиот дел од содржината на плочките и колониите остануваат на агар плќката. Можат да се користат два вида проби за пребарување на phage или бактериските колонии врзани на мембраната: 1. Специфични антитела за да се идентификува протеинот што се формира како производ на генот на бараниот клон (Western blot): и 2. Специфични ДНК проби за да се означи cDNA на саканиот клон со хибридизација. Клонот се идентификува со антитела на генетскиот производ

Антителата на одреден протеин честопати се користат за идентификување на соодветниот ген со Western blot. За Оваа метода е потребно претходно да се прочисти доволно количество од соодветниот протеин за да се добијат поликлонски антитела преку имунизација на животни. Доколку антителата се користат за идентификување на генетскиот производ, cDNA библиотеката ммоа да се вметне во соодветен експресирачки вектор. Ова е клонирачкиот вектор, кој ја олеснува транскрипцијата на вметната ДНК молекула, а резултирачката mRNA тогаш се преведува во соодветниот протеин, кој може да биде препознаен од антителото. [pic] Слика 22.7 За пребарување на библиотеката на гени, се подготвува блот со ставање најлонска или нитрицелулозна мембарана на агар плочката. Со означена проба (А. ДНК проба или антитело) бараната ДНК или соодветниот генски производ се детектира на блотот како темна точка на рентгенскиот филм, предизвикано со радиоактивност или хемолуминсцентна светлина. Соодветниот клон се идентификува на агар плочката со споредување на позициите и може да се подигне со чепкалка за понатамошно проширување.

Векторот содржи промотерска секвенца, која го контролира започнувањето на транскрипцијата на вметнатиот ген и честопати исто така и секвенца за завршување на транскрипцијата на својот крај. Во пракса, бактериите врзани за блот мембраната се прекинати и ослободените бактериски протеини се фиксираат за мембраната. Кога phages се користат како вектор, прекинувањето на клетките не е потребно, бидејѓи самите phages ја разложуваат клетката и со тоа ги ослободуваат клеточните протеини, кои потоа се фиксираат на блот мембраната. Потоа се додаваат антителата, кои специфично се поврзуваат со соодветниот протеин, но се измиваат од останатите делови од мембраната. Вообичаено, се користи второ антитело, кое го препознава првото антитело, за да се детектиа врзаното антитело (Слика 22.8) Порано, второто антитело се обечежуваше со радиоактивен 125јод. Денес, се користи ECL техниката (подобрена луминисценција). Ова ввклучува пероксидаза која се поврзува со второто антитело. Оваа пероксидаза ја катализира оксидацијата на додадениот луминол (3-аминофталитик ацид хидразид) со Н2О2, проследено со емисија на сино луминисцентно светло. Со примена на засилувач на луминисценцијата, интензитетот на оваа хемолуминисценција може да се зголеми со фактор 1.000. По инкубацијата со второ антитело, блот мембраната се мие; Н2О2, луминолот и засилувачот на луминисценција се додаваат; и се изложуваат околу 1 час на рентгенски филм. Позитивната колонија може да се препознае како темна дамка на ауторадиографија (слика 22.7). Положбата на позитивниот клон на агар плочката може да се идентификува од положбата на дамката на блот мембраната. По првото пребарување, очигледно позитивниот клон може всушност да соржи неколку клонови, поради високиот интензитет на бактеријата. Поради тоа, колонија земена од позитивниот регион со чепкалка, се разредува и повторно се става на агар плочка. [pic] Слика 22.8 Антитело врзано за протеинот се препознава со второ антитело кое е поврзано со пероксидаза. Пероксидазата ја катализира оксидацијата на луминолот со Н2О2, со емитување луминисцентна светлина, кое се детектира со изложување на рентгенски филм

Со повторување на процедурата за пребарување опишана погоре (рескрининг), конечно се добиваат единечни чисти клонови. Позитивните phage плочки исто такан повторно се растат во бактерии и се стават на плочки за да се добијат чисти клонови.

Клон може исто така да се идентификува со ДНК проби

Со оваа процедура, phages или бактериите присутни на блотмембраната прво се разложуваат, а протеините се отстрануваат. Преостанатата ДНК потоа се разложува на поединечни нишки кои се цврсто врзани со мембраната. Комплементарните ДНК секвенци, кои се радиоактивно обележани со 32Р-обележани деоксинуклеотиди се користат како проби. Овие проби се врзуваат со хибридизација на присутната cDNA на блот мембраната. Идентифиацијата на поозитивните клонови претходи преку ауторадиографија, слично на процедурите за детекција опишани претходно. Хемиски синтетизираните олигонуклеотиди од околу 20 бази исто така се користат во ДНК пробите. Овие проби се радиоактивно обележани на 5' крајот со 32Р-фосфат и се користат особено кога постојат само мали количини прочистени протеини, кои не се доволни за производство на антитела. Сепак, со многу мали количества протеини, можно е да се одреди со микросеквенционирање дел од секвенцата на протеинот на амино киселините на N-терминалот. Од таква делумна секвенца на аминокиселини, може да се одреди соодветната ДНК секвенца според генетичкиот код, за да се произведат олигонуклеотидни проби со хемиска синтеза со користење на автоматски синтетизатори. Сепак, дегенерацијата на генетскиот код значи дека амино киселините честопати се кодирани со повеѓе од еден нуклеотиден триплет (слика 22.9). Ова се зама предвид за време на изработката на олигонуклеотидите. Кога, на пример. третата база од триплетот што кодира лизин може да биде или А или G, мешавина од прекурзори за двата се додава во синтетизаторот за време на поврзувањето на третата база од овој триплет со олигомерот. За да се внесе третата база од аланин триплетот, во синтетизаторот се додава мешавина од сите четири нуклеотидни прекурзори. [pic] Слика 22.9 Дегенериран олигонуклеотид ги содржи сите можни секвенци за кодирање на одредена секвенца на амино киселина

„Дегенерираниот“ олигонуклеотид прикажан на слика 22.9 е всушност, мешавина од 48 различни олигонуклеотиди, од кои само еден ја содржи точната секвенца на посакуваниот ген. Кога протеинот кодиран од посакуваниот ген не е прочистен, соодветната секција гени од поврзаните организми може да се користи како проба. Домените со специфични секвенци на амино киселини честопати се конзервираат во ензими или други протеини (на пр. транслокатори) дури и од далечно сродни растенија и се кодираат со соодветно слични генски секвенци. Откако cDNA е успешно изолирана, следниот чекор вообичаено е да се одреди базната секвенца. Во се поголем степен, ДНК секвенционирањето се изведува со автоматски анализатори, кои овде нема да ги опишеме.

Гените што кодираат непознати протеини можат да се изолираат со комплементација

Во некои случаи, моѓно е да се изолира cDNA што кодира непознат протеин, кој е дефиниран само по својата функција. Еден метод за идентификување на генот што кодира ваков непознат протеин е со комплементација на дефициентните мутанти од бактерии или габи по контаминација со плазмиди од cDNA библиотеката (слика 22.10). Плазмидите кои можат да се амплифицираат во E.coli како и во габи се достапни како клонирачки вектори и можат да се користат за експресија на кодираниот протеин [pic] Слика 22.10 Идентификација на ген на растение со комплементација на габичен мутант со недостиг на преием на сукроза

Гените можат да се откријат со помош на транспосонс или Т-ДНК

Друга можност да се идентификуваат гените, освен функцијата на нивните генетски производи, е да се короистат транспосоните. Транспосоните се ДНК секвенци кои моѓат да „скокаат“ во геномот на растение, што понекогаш резултира со препознатлива елиминација на функцијата на генот. Ова би можело, на пример, да биде губење на способноста да се синтетизира цветен пигмент. Во таков случај, генетска проба базирана на позната транспосон секвенца се користи за идентификување на ДНк преку хибридизација на регионот од геномот во кој е вметнат транспосонот. Со користење на веќе споменатите процедури за клонирање и скрининг, можно е да се идентификува генот, во овој случај генот за ензимот за синтетизирање на пигментот на цветот, и да се одреди секвенцата на амино киселината на соодветниот ензим со анализа на секвенцата на ДНК. Лабелирањето на генот со вметнување на транспосон се нарекува тагирање на гените. Алтернативен метод, кој ја наследи транспосон техниката на следење на гените, е Т-ДНК техниката. Вметнувањето на Т-ДНК во геномот предизвикува случајни мутации (мутанти со вметната Т-ДНК). Локусот на гени во кој Т-ДНК „скокнала“ се идентификува со користење на генска проба и потоа се секвенционира. Комплетната секвенца на мутираниот ген потоа се идентификува, вообичаено со споредување на релевантниот дел од генот во базата на подтоци од познатата секвенца на мутантите со вметната Т-ДНК. На пример, фирмата Сингента прави банка на податоци со податоците од околу 100.000 мутанти со вметнување Т-ДНК на Arabidopsis.

2. Агробактериите имаат способност да ги трансформираат растителните клетки

Грам негативните бактерии во почвата од видот Agrobacterium tumefaciens (новата номенклатура Rhizobium radiobacter) предивикува раст на туморот на повредените места на различни растенија, често на стеблото, што може да доведе до формирање на крунски израстоци. Туморното ткиво од овие израстоци продолжува да расте како калус во културата од клетки. Зрелите диференцирани растителни клетки, кои нормално повеќе не се делат, можат да се стимулираат на неограничен раст со додавање на фитохормони auxin и cytokinin. На овој начин, туморот во форма на калус, може да се формира од диференцирана растителна клетка. Израстокот се формира од агробактерија на речиси истиот начин. Погодените растенија се присилени да произведуваат големи концентрации auxin и cytokinin, што ресултира со распространување на ткивото на растението што доведува до раст на туморот.

[pic] Слика 22.11 Опините се формираат од амино киселини и кетокиселини (А) или амино киселина и хексоза (В)

Бидејќи капацитетот за зголемена синтеза на cytokinin и auxin се наследува по поделбата на клетките од сите последователни клетки, калус културата на ткивото на крунскиот израсток моѓе да се размножува без додавање фитохормони.
Туморот со крунски израсток има развиено уште една можност: Тој може да произведува различни производи наречени опини преку кондензирање на амино киселините и α-кетокиселините или амино киселини и шекери. Овие опини се формираат во толку големи количини што се излачуваат преку крунскиот израсток. Сликата 22.11 покажува octopine, lysopine, nopaline и agropine како видови опини. Секоја Agrobacterium нишка поттикнува синтеза на само еден опин.
Конверзијата на диференцирани растителни клетки во клетки што произведуваат опински тумори се јавува без агробактеријата да влезе во овие клетки. Ова репрограмирање на растителните клетки е предизвикано од трансфер на функционалните гени од бактеријата во геномот на погодените растителни клетки. Agrobacteria се здобија со способност да ги трансформираат растенијата за да ги користат како место за призводство на нивната храна. Џеф Шел го нарече овој нов паразитизам генетска колонизација.
[pic]
Слика 22.12 Дијаграм на Ti-плазмид. Т-ДНК која се трансферира во геномот на растението претставува 7-13% од Ti-плазмидот и се дефинира по своите леви и десни гранични секвенци. Т-ДНК содржи ензими за кодирање гени за синтеза на фитохормоните cytokinin и auxin и специфичен опин. Т_ДНК се транскрибира и преведува само во клетката на растението

Ti-плазмидот содржи генетски информации за формирање тумори

Фитопатогенетската функција на A. tumefaciens е кодирана во Ti-плазмидот што предизвикува тумор, со големина од околу 200 kbp (слика 22.12). Растенијата се заразуваат со бактерии на раните, најчесто се јавуваат на основата на стеблото. По повредата, растенијата излачуваат фенолски супстанци како одбрана од патогените. Овие феноли се користат од агробацтеријата како сигнал за започнување на нападот. Фенолите ја стимулираат експресијата на околу 11 гени за вирулентност (вир гени) кои се наоѓаат во регионот на Ti-плазмидот. Овие вир гени ги кодираат протеините за вирулентност, кои го овозможуваат трансферот на бактериските гени што предизвикуваат тумор во геномот на растението. Од секција долга од 12 до 25 kbp од Ti-плазмидот наречена Т-ДНК вир нуклеазата издвојува една нишка.
[pic]
Слика 22.13 Agrobacteria ги трансформира клетките на растението за да ги принуди да произведуваат опини како храна за нив. Ткивата на повреденото растение ја предизвикуваат експресијата на вирулентните гени во Ti-плазмидот на agrobacterium што резултира со синтеза на протеини за вирулентност, што предизвикува едно вержниот ДНК сегмент. познат како Т-ДНК да биде извлечен од плазмидот, пренесен во клетката на растението и интегриран во молекуларниот геном.

За поврзување на бактеријата со клетката на растението, вир протеините формираат пилус, влакнеста структура преку која Т-ДНК се спроведува. По префрлувањето во клетката на растението, Т-ДНК нишката продолжува понатаму во јадрото. Вир енкодираните протеини ја штитат Т-ДНК од нападите со тоа што ги разградуваат ензимите на растението и исто така го олеснуваат транспортот преку порите на јадрото до јадрото. Десниот граничен регион на Т-ДНК има важна функција во неговата интеграција во јадрениот геном на растението. Т-ДНК се интегрира по случаен избор во хромозомите и кога се вметнува во генот, може да ја елиминира функцијата на тој ген. Т-ДНК интегрирана на овој начин во јадрениот геном има особини на евкариотски ген и се наследува по Менделеев начин. Таа се реплицира од клетките на растението како да е негова сопствена ДНК, и бидејќи содржи евкариотски промотери, исто така и се транскрибира. Уште повеќе, Т-ДНК кодира еден од двата ензима, различни од нишка до нишка, за синтеза на специјален опин. Т-ДНК интегрирана во геномот на растението така пренесува генетски информации за синтеза на citokinin и auxin за да предизвика раст на туморот, како и информациите за растението да синтетизира опин. Ензимите потребни за катаболизам на соодветниот опин се кодирани во тој дел на Ti-плазмидот кој останува во бактеријата. Така, паралелно со трансформацијата на растителната клетка, ензимите за деградација на опините ги синтетизира бактеријата.