Inleiding:
Spektrofotometrie word gebruik vir die idientifikasie van verbindings, konsentrasies van verbindings te meet en ook om ensiemreaksies te bestudeer. Proteiene absorbeer ultraviolet lig agv peptiedverbindings en aromatiese aminosuurresidue wat in dit voorkom. Peptied verbindings in proteiene veroorsaak maksimale absorpsie by 190nm. Spesifieke absorpsiekoeffosiente van proeteine met min of meer dieselfde molekulere massa is dieselfde groote nl. 210nm omdat proteiene met dieselfde molekulere massa dieselfde hoeveelheid peptide verbindings bevat, maar ander tipe verbindings soos karboksielsure, bufferione, bikarbonate, ander aromatiese verbindings en alkohole wat in die proteiene voorkom word absorbeer ook dikwels ultraviolet lig en veroorsaak onakkurate metings. Die problem kan opgelos word deur spesifieke kleurreagense by die proteien oplossings te voeg wat met dit reageer om gekleurde verbindings te vorm in die sigbare liggebied. dit vorm ‘n violet kleur. Deur spektofotomatrie kan die intensiteit van die kleur maklik bepaal word en sodoende die konsentrasie van die proteien in oplossing. In die eksperiment gaan die konsentrasie van ‘n onbekende proteien dmv spektrofotometrie bepaal word en mbv Lowry reagense en die Beer-Lambert metode. Die Beer-Lambert wet bepaal dat die verhouding tussen die konsentrasie van ‘n verbinding en die hoeveelheid lig wat dit kan absorbeer direk eweredig is en sodoende kan ‘n standaardkurwe grafiek opgestel word met ‘n reguit lyn wat dit voorstel. Die volgende simbole en vergelykings:
A α C l ( by ‘n sekere golflengte)
A = ԐC l
A = Absorpsie
C = Konsentrasie van verbinding l = Ligpadlengte wat gegeld het α = Absorpsiekoeffosient Om die verslag op te stel was drie eksperimente gedoen om die konsentrasie van ‘n onbekende proteienoplossing te bepaal. Eerstens was ‘n standaardkurwe opgestel van ‘n bekende proteien en daarna ‘n reeks verdunnings met ‘n onbekend proteien en laastens mbv die vorige twee eksperimente was die konsentrasies vasgestel van die verdunde proteienoplossings.
Metodes:
Eksperiment 1: Opstelling van standaardkromme vir die bepaling van proteien konsentrasies mbv Lowry metode.
Eksperiment 2: Verdunning van ‘n onbekende proteienoplossing
Eksperiment 3: Bepaling van proteienkonsentrasie van ‘n onbekend proteienoplossing

Materiaal Gebruik | Kwantiteit: | Spektrofotometer | 1 | Proefbuise | 16 | 25ml Volumetriese Fles | 1 | 100ml Volumetriese Fles | 1 | Mikropipet | 1 | Koevette | 7 | Stophorlosie | 1 | Vortex menger | 1 |

Reagense Gebruik: | Standaard Proteienoplossing | Gedistileerde Water | Onbekende Proteienolpossing | Lowry A | Lowry B |

Eksperiment 1:
Tabel 1: Bereiding van verdunningsreeks van ‘n standaard proteienoplossing Buis No | Standaard Proteienoplossing (ml/mg) | Dist H2O | 1 (blanko) | 0.00 | 1.00 | 2 | 0.20 | 0.80 | 3 | 0.40 | 0.60 | 4 | 0.60 | 0.40 | 5 | 0.80 | 0.20 | 6 | 1.00 | 0.00 |

Eksperiment 2:
Tabel 2: Bereiding van verdunning van ‘n onbekende proteienoplossing Verdunning | mL Onbekende proteienoplossing | mL Dist H2O | Eindvolume | 1:1 | 1 ml | 1 ml | 2 | 5X | 1 ml | 4 ml | 5 | 1:9 | 1 ml | 9 ml | 10 | 50x | 0.5 ml | 24.5 ml | 25 | 1:49 | 2 ml | 98 ml | 100 | 200x | 0.5 ml | 99.5 ml | 100 |

Vir meer gedetaileerde beskrywings van metodes en materiaal gebruik sien Biochemie 214 2014 Praktiese Notas (Universiteit Stellenbosch – Departement Biochemie – BIOCHEMIE 214 & 244, L du Toit en E. Foster)

Resultate:
Tabel 3: Absorpsiewaardes vir standaard proteienoplossings ( Verwys na Eksperiment 1, Tabel 1 in Metodes) Buis nr | Absorpsie by 540nm | 1 | 0.00 | 2 | 0.128 | 3 | 0.284 | 4 | 0.361 | 5 | 0.447 | 6 | 0.546 |

Tabel 4: Absoerpsiewaardes vir onbekende proteienoplossings ( Verwys na Eksperiment 2, Tabel 2 in Metodes) Buis nr | Absorpsie by 540nm | 7 | 2.310 | 8 | 1.614 | 9 | 1.141 | 10 | 0.829 | 11 | 0.258 | 12 | 0.236 | 13 | 0.084 |

Tabel 5: Konsentrasies van die standaard proteienoplossing Buis nr | Ml Standaard Proteienoplossing | Mg Proteien | Eindvolume (mL) | mg/mL Proteien | % m/v Proteien | Absorpsie by 540nm | Ԑ %540nm | 1 | 0.00 | 0.00 | 1 | 0.00 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 2 | 0.20 | 0.06 | 1 | 0.06 | 0.006 | 0.128 | 21.33 | 3 | 0.40 | 0.12 | 1 | 0.12 | 0.012 | 0.284 | 23.67 | 4 | 0.60 | 0.18 | 1 | 0.18 | 0.018 | 0.361 | 20.06 | 5 | 0.80 | 0.24 | 1 | 0.24 | 0.024 | 0.447 | 18.42 | 6 | 1.00 | 0.30 | 1 | 0.30 | 0.030 | 0.546 | 18.20 | | | | | | | Gemiddeld | 16.95 |

Figuur 1: Standaardkurwe van absorpsie by 540nm, teenoor proteienkonsentrasie (mg/mL), vir die standaard proteien verdunningsreeks ( Tabel 5)