All rights preserved by Cell Organization. n:泛素：相同的小分子，不同的降解途径 摘要：泛素是一种常见的将底物带入降解途径的标签，在三种途径中都发挥作用：蛋白酶体途径、溶酶体途径、自吞噬途径。决定底物进入哪一种途径很可能是泛素链长度和化学键类型决定的。每种特殊的泛素化构象对应特定的受体，或者是对于不同途径的去泛素化活动的敏感程度不同。
将稳定的同位素标记氨基酸喂给小鼠，通过分析这些氨基酸的命运，可以得到体内蛋白的动态状况。Rudolf在20世纪30年代末叶，做出了为同位素标记技术奠基的经典实验。这项关键的技术使得通过质谱的简单实验测定很多种蛋白的讲解速率成为可能(Kristensen et al., 2008)。在这项发现之后，溶酶体被认为是细胞蛋白降解的关键部分，溶酶体可以利用其中的酸性蛋白酶降解各种蛋白质。然而，将溶酶体的pH调成碱性，大多数胞内蛋白的半衰期并未发生改变，说明溶酶体作为蛋白降解中心的假设被严重怀疑。随后泛素化-蛋白酶体成为了一种蛋白降解途径的全新正统解释。这种假说的中心观点是多肽共价修饰的底物可以被特异地带入蛋白酶体进行降解。
随后研究中发现，泛素标签提供一个信号将内吞的受体带到溶酶体，还可以标记细胞器，通过第三种降解途径——自噬将其降解。泛素化在细胞降解蛋白质过程中是无处不在的，甚至比之前的设想更加普遍（图1）。在这篇综述中，我们将涉及泛素标签如何选择降解途径，以及不同降解途径之间的相互联系。
1.概述
酶E2连接着泛素被酶E3募集，选择性地修饰蛋白底物的赖氨酸残基。可以导致底物蛋白连接一个或者多个泛素分子。泛素的七个赖氨酸提供不同的连接方式，每种都会形成不同的三维构象。所有的七种构象都在真核细胞中存在(Xu et al., 2009)。E2和E3选择修饰底物的组合方式决定了上述连接方式。人类基因组编码20多种不同的泛素结合域，特异性连接的规则被证实。一种实现特异连接的方式就是对UBD的空间重排，以表达单个蛋白或者把不同分子的结构域结合到一起。
2.蛋白酶体降解途径
早期的实验表明蛋白酶体的信号包含赖氨酸-48连接的由至少四个分子组成的泛素链。这个结论基于以下两个实验，一是生化分析网状细胞裂解液体系中的一种模式底物，β半乳糖苷酶；二是酵母中泛素赖氨酸突变K48R不能成为独立的泛素来源(Finley, 2009; Xu et al., 2009)。未连接的K48多泛素链对于蛋白酶体的亲和性从二聚体到四聚体增加了一百倍，四聚体以上亲和性骤减(Thrower et al., 2000)。
现在，很多实验表明实际上蛋白酶体会欣然接受其他类型的泛素链。间接证据就是特异的蛋白酶体阻遏不会导致只有K48多泛素链的聚集的结果。实际上，K63以外的所有链都增加了(Jacobson et al., 2009; Xu et al., 2009)。在细胞分裂中，人的APC/C募集两个E2连接酶，专有地结合并产生K11连接的泛素链(Song和Rape, 2010)。去除这个部分会导致降解程序失败，细胞可以观察到有丝分裂缺陷。体外实验表明K63修饰的二氢叶酸还原酶提供了一种高效的蛋白酶体底物(Hofmann和Pickart, 1999)。 图1、泛素是蛋白降解的一种常见标签 图2、主要降解途径的泛素识别

蛋白酶体由多蛋白裂解位点的核(20S)以及一个19S的调控部分组成。底物先被六聚ATP酶和调控部分展开以便进入蛋白酶体的核。调控部分的其他区域可能负责底物的募集(Finley, 2009)。Rpn10和Rpn13和泛素化的底物分别通过UIM和Pru区域相互作用。UBL/UBA蛋白家族是纯化后的蛋白酶体的亚化学计量学组成部分，通过UBA结合泛素，通过UBL结合蛋白酶体调控部分。它们被认为是远距离搜寻泛素化底物并且把它们呈递给蛋白酶体。特定的蛋白酶体结合的泛素受体被连接到要降解的底物。
哺乳动物调控部分有三个连接的去泛素化酶DUBs：POH1/PSMD14，USP14和UCH37 (Finley, 2009)。它们都有不同的链连接特异性。这些DUB的功能是什么？一个重要的功能是回收泛素以维持细胞的泛素总量。JAMM/MPN+蛋白酶POH1被认为会特异地拆开K63连接的链并且断开连接底物和最近的泛素的异肽键，使得移除整个泛素链成为可能。它也控制着底物是否能够进入蛋白酶体腔，也就把底物降解和回收泛素偶联起来(Yao和Cohen, 2002)。泛素-乙醛敏感的半胱氨酸酶负责所有向K48连接链的活动和K63连接链的拆分(Jacobson et al., 2009)。一个有意思的事情是这些DUB功能的整合可以提供一种校正机制，如果降解没有在规定的时间内完成，可以协助底物与蛋白酶体分离(Jacobson et al., 2009)。在这种规则下，USP14的一个化学抑制剂可以增加蛋白降解的速率(Lee et al., 2010)。在酵母中，结合蛋白酶体的泛素连接酶Hul5可以通过链增长酶E4抑制Ubp6活性(Crosas et al.,2006)。所以泛素连接酶活性与DUB活性的平衡决定了受体的命运。
3.胞内溶酶体降解途径
溶酶体途径是受体蛋白和通道蛋白之类的膜蛋白降解的主要方式。它的标志是需要v-ATP酶介导的细胞器酸化。内吞的蛋白被回收到质膜，或者随着MVB从分选内吞体成熟，被运输到MVB内部的小泡。有些受体将泛素用作内部信号，有些泛素化的受体，比如表皮生长因子受体，富含适配器结合位点。泛素通过内吞小泡分选复合体把内吞的蛋白标记送到溶酶体。不可逆连接到受体上的单泛素化足以作为信号完成分选。然而，实验表明K63作为内吞小泡分选的最初泛素链型。早期酵母实验表明二聚泛素通过K63连接增强分选，近期研究详细阐述了下游透性酶Gap1的调节机制。实验结论是，单泛素化足以其实内吞进入溶酶体，但是有效的分选需要带有K63连接的多泛素化(Lauwers et al., 2009)。与结论相一致地，K63连接的多泛素化可以将哺乳动物TrkA和I类MHC蛋白送入溶酶体(Duncan et al., 2006; Geetha和Wooten, 2008)。
ESCRT-0复合体，包括HRS和STAM（均含有UIM和VHA域），可以结合泛素。该复合体是泛素化货物分选机制的第一步。完整的ESCRT-0对于四聚K63连接泛素链比单泛素亲和力高50倍，但是只比四聚K48连接泛素链高2倍(Ren和Hurley, 2010)。ESCRT-0被募集到内吞体，是通过连接3-磷酸磷脂酰环己六醇、网格蛋白和下游ESCRT-I复合体。另一种ESCRT-0复合体包含TOM1，Tollip和Endofin，拥有HRS-STAM复合体的所有显著特征。这两种复合体是多余的或者被用于接收不同货物尚不可知。与蛋白酶体有着惊人的相似性，ESCRT机制有着和DUB活动的至少两种联系,分别是AMSH何USP8，分别属于JAMM/MPN+和USP家族。在酵母中，E3连接酶主要活性Rsp5可以连接STAM相似物Hse1，提供一种抑制Ubp2和Ubp7达到平衡的方式(Ren et al., 2007)。第三种ESCRT连接的DUB——Doa4是降解途径中泛素回收所必须的。尽管对于分选来说去泛素化不是一个必须的步骤，有可靠数据表明校正和泛素回收类似于蛋白酶体的DUB (Clague and Urbe´ , 2006)。
4.自噬途径
自噬途径的特征是通过由前自噬体结构双层膜包裹的区域捕捉细胞质和细胞器。和MVB相同，自噬体可以和晚期内吞体和溶酶体融合，形成内吞溶酶体，在其中消化双层膜结构。它很适合于消化细胞质内物质。细胞器和蛋白聚集物等细胞质内物质和蛋白酶体不相容。
鉴定自噬基因和生化分析显示了两个翻译后修饰的通路，很类似于泛素化。一种情况，Atg12和Atg5稳定连接。另一种情况下，Atg8通过E2酶转移，和磷脂酰乙醇胺结合。这是打开自噬前结构的前提，这一过程可能被膜融合辅助。在哺乳动物细胞内，Atg8是LC3和它的脂肪化的形式LC3-II.实际上，人的基因组有六个Atg8同源片段，即LC3/GABARAP家族。
自噬被普遍认为是没有选择性的降解途径，然而有些特定的结构和细胞器被选择性地通过这种通路去除了。比如，作为在细胞培养中去除偶联的结果，线粒体在网状细胞成熟过程中去除。核糖体、过氧化物酶体和病原体蛋白聚集体也可以被自噬方式降解。最近的研究得出了一个选择自噬的理论，在其中泛素化是非常重要的过程(Kirkin et al., 2009)。普遍上讲，如果被降解物被泛素标记，那么一个与之连接的适配器分子需要连接到富有Atg8/LC3的前自噬体膜。这一类的原型适配器是p62/绝缘体1，它连接UBA和LIR骨架。LIR骨架和临近BRCA1基因1共用一个区域结构(Pankiv et al., 2007)。P62被暗示可以清除蛋白聚集体，泛素化对于这个过程很重要。近期的数据显示对于去极化的线粒体，E3泛素化连接酶Parkin募集实现泛素化的过程不可缺少(Geisler et al., 2010)。用没有赖氨酸的泛素突变体融合红色荧光蛋白，Kim证实在p62依赖的方式下，不可逆单泛素化足以将可溶蛋白送入自噬体(Kim et al., 2008).。
在酵母中，一个包含Ubp3:Bre5 DUB复合体的选择性通路可以去除成熟核糖体(Kraft和Peter, 2008)。在缺少Ubp3的细胞中，核糖体和组分和泛素富集。尽管已经建立了泛素化和自吞噬的内在联系，泛素化具体起到了什么作用仍不清除。一个模型假定泛素可以保护核糖体不被自噬，然后可以提高Ubp3活性。另一种方式，作为和线粒体类似的内吞信号，让泛素有活性的修饰可能是必要的。支持这个假说的实验是，一个温度敏感带有E3连接酶Rsp5缺陷显示出一种核糖体吞噬缺陷，而只缺少Ubp3的细胞不会有这样的现象(Kraft和Peter, 2008)。如果假设正确，那么通过去泛素化保持泛素量稳定的法则就是一致的。

5.降解途径间的相互依赖
不同种类的细胞降解途径会相应不同。在大多数细胞培养无生存压力条件下，最主要的降解方式是蛋白酶体途径，但是在肌肉细胞中，溶酶体途径涉及占到长期生存细胞的40%。在萎缩的肌肉细胞中，两种途径被FOXO3转录调控提高活性(Zhao et al., 2007)。然而，蛋白酶体自身会被饥饿诱导的自噬途径降解(Kristensen et al., 2008)。
三个降解途径的联系表明特异地阻遏某一种会影响泛素水平，从而间接使其他降解途径受到影响。例如，在激活的Met受体降解中，抑制蛋白酶体导致泛素减少，溶酶体降解途径则对于泛素变化非常敏感(Carter et al., 2004)。蛋白酶体抑制也会激活互补效应，导致自噬。自噬的适配器蛋白p62在蛋白酶体途径中也起作用，另外E3连接酶Parkin会在线粒体上放置自噬标签，而在其他途径中可以把蛋白运到蛋白酶体。VCP/p97协同许多泛素依赖的过程，包括蛋白酶体依赖ERAD通路，但是有趣的是它最近被发现时一个自噬体成熟的必须因子，还是蛋白酶体的抑制剂(Tresse et al., 2010)。
MVB和自噬通路出现在内吞体、溶酶体晚期，并且都对于质子泵和磷酸肌醇3激酶抑制剂敏感。自噬体形成对于早期内吞途径扰动敏感，会导致后期形成内吞体行至的变化。偶而地，在这两个系统中目的论的不同还很模糊，泛素化的细胞质蛋白可以被溶酶体降解，受体质膜蛋白被蛋白酶体分解。很多事实证明有一个蛋白酶体库和影响受体分选的内吞体相联系(Geetha和Wooten, 2008; Gorbea et al., 2010)。
6.总结
泛素标签是三种蛋白降解途径共有的。这其中有一个谜题：一个给定的底物如何被选取进入特定的通路？这取决于不同的参数例如位置、链长和连接类型。一个明显的对于内吞体途径和K63连接链的误解出现了。这可以简单地反映细胞内特定E3连接酶和高浓度泛素连接蛋白结合，激活ESCRT机制，而不是蛋白酶体(Kristensen et al., 2008)。全球范围内一项新技术实现了对于单个蛋白降解的测定。这会产生一个对于降解速率可以理解的理论，用于实验扰动或者疾病状态。打开了一扇系统了解蛋白降解的大门。

7.鸣谢
S.U. is a Cancer Research UK Senior Research Fellow.

8..参考文献
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