ФОРМИРОВАНИЕ мИП ДЛЯ СОЗДАНИЯ коммерческого препарата гамма-интерферона (ИФН-гамма)

Интерферон гамма (ИФН-гамма) – ключевой иммуномодулятор, обладающий сильным антивирусным и антипролиферативным действием. Его используют в комплексной терапии онкологических и аутоиммунных заболеваний, тяжелых вирусных и бактериальных инфекций, сопровождающихся иммунодефицитными состояниями. ИФН-гамма эффективен для лечения больных грануломатозом, раком яичников, туберкулёзом, хроническим вирусным гепатитом В и С, лёгочным фиброзом, рассеянным склерозом, лимфогрануломатозом, остеопетрозом; при цитомегаловирусной инфекции. Новые перспективы открываются в связи с лечением препаратом ИФН-гамма больных различными видами гриппа, в т.ч. птичьим гриппом. Промышленное производство препаратов интерферона: – лейкоцитарный (получают из клеток донорской крови); – рекомбинантный (получают из генетически модифицированных организмов). Для рекомбинантного ИФН-γ особенно важна проверка на биологическую активность, так как из-за структурных особенностей молекулы проверки на чистоту и гомогенность недостаточно. В данный момент на мировом рынке существуют следующие препараты рекомбинантного ИФН-гамма, получаемые в культуре клеток бактерии E.coli.: «Имукин» (Германия), «Актимьюн» (США), Ингарон (Россия). В 2002 г. биотехнологическая фирма InterMune Pharmaceuticals, Inc. заявила о получении от Администрации по Контролю за продуктами и лекарствами США (U.S. Food and Drug Administration) разрешения для своего главного продукта - препарата Actimmune на лечение идиопатического фиброза легких (idiopathic pulmonary fibrosis - IPF), образования спаек в легких. Это заболевание нередко приводит к смерти, им страдают 60-80 тыс. американцев. Также Актимьюн применяется при лечении рака яичников, фиброза печени, хронического гепатита С, некоторых других хронических вирусных инфекций, а также птичьего гриппа. Цена препарата Актимьюн – $135 США за 1 млн. МЕ (50 мкг). Обычная дозировка для взрослых – 1 млн. МЕ на кв. метр поверхности кожи, 3 раза в неделю. Таким образом, стоимость лечения одного больного при площади поверхности тела 1 кв. метр (средняя величина) составляет $42000 США в год. Препарат Актимьюн получают путем наработки в клетках E.coli, содержащих ДНК, кодирующую этот белок, поэтому белок является негликозилированным. В сентябре InterMune Pharmaceuticals, Inc. получила от регулирующих организаций США разрешение на перенос производства препарата Actimmune из Калифорнии, где его выпуском по заказам InterMune Inc. занималась фирма Genentec Inc., в Вену (Австрия). Новой производящей Actimmune компанией стала немецкая Boehringer Ingelheim. Она поставляет интерферон гамма-1-b под торговым названием Имукин (Immukin) во все страны мира, кроме Соединенных Штатов, Канады и Японии. В названных странах правом на продвижение интерферона гамма-1-b под торговым названием Актиммун (Actimmune) обладает американская компания InterMune Pharmaceuticals, Inc. Иммукин и Актиммун разрешены только для лечения пациентов, больных злокачественным остеопетрозом и хроническим гранулематозом [Скотт Харконен (Scott Harkonen) был президентом InterMune, когда компания распространила пресс-релиз, утверждая, что ее препарат Actimmune против легочных заболеваний продлевал жизни пациентов с фатальным заболеванием легких, известным как IPF (идиопатический легочный фиброз, idiopathic pulmonary fibrosis). Это стало серьезным нарушением правил FDA, давно ведущего жестокую борьбу против маркетинга лекарств «вне предписания». За свои действия Харконен получил 20 лет тюремного заключения и заплатил штраф в размере 250 000 долларов. Во время вынесения приговора он работал президентом компании CoMetics]. В России единственный препарат ИФН-гамма зарегистрирован в 2005 году под названием Ингарон. Производитель – ООО «НПП «Фармаклон», Россия. Показания к применению: профилактика и лечение (в составе комплексной терапии) гриппа (в т.ч. гриппа «птичьего» происхождения); лечение хронического вирусного гепатита В и С, ВИЧ/СПИД инфекции и туберкулеза легких в комплексной терапии; профилактика инфекционных осложнений у больных с хронической гранулематозной болезнью; лечение онкологических заболеваний в комплексной терапии в качестве иммуномодулятора, в том числе в комбинации с химиотерапией; лечение генитальной герпесвирусной инфекции и опоясывающего лишая (Нerpes zoster) в монотерапии; лечение урогенитального хламидиоза в комплексной терапии.

РЫНКИ СБЫТА ПРЕПАРАТОВ ГАММА-ИНТЕРФЕРОНА И КОНКУРЕНЦИЯ НА НИХ. Объёмы продаж рекомбинантных белков в мире характеризуются следующими показателями:
|Продукт |Объем продаж, млн. долл. |
|Erythropoietin |5 300 |
|Interferons |3 400 |
|Insulin |3 100 |
|Human growth hormone |1 500 |
|Colony stimulating factors |1 600 |
|Clotting Factors |1 200 |
|Interleukins |160 |
|ИТОГО |16260 |

На мировом рынке лекарственных препаратов группа интерферонов по объёму продаж входит в первую пятёрку рекомбинантных (т.е. полученных с помощью генной инженерии) белков. Мировой объём продаж интерферонов в настоящее время превысил 5 миллиардов долларов США в год. В частности, объем продаж ИФН-гамма в США с 2001 по 2006 г. рос с 60 до 500 миллионов долларов США, что соответствует темпам роста чуть более 50% в год. Продажи “Актиммьюна” в США растут на протяжении последних лет с 2005 г. Сходные показатели имеют и препараты-аналоги — Иммукин (Immukin), Ингарон.

[pic]

Потенциальная емкость отечественного рынка с учетом широкого спектра применения препаратов гамма-интерферона оценивается в 43,2 млн. человек (30% населения РФ). Конкурентом на российском рынке является препарат «Ингарон».

Целью проекта является создание эффективного коммерческого препарата гамма-интерферона (ИФН-гамма), практически идентичного природному интерферону человека. Разработана технология получения гамма-интерферонов из молока трансгенных кроликов с данными гибридными генами. Трансгенные животные[1], в отличие от бактерий и дрожжей, дают возможность получать рекомбинантные белки, в которых уже произведена посттрансляционная модификация (гликозилирование, карбоксилирование, фосфорилирование), тем самым позволяют получать необходимые белки, практически идентичные природным. Благодаря этому может быть достигнута более высокая удельная активность ИФН-гамма, а также снижен риск возникновения аллергических реакций и других побочных эффектов. Негликозилированные белки, как правило, более иммуногенны, менее активны и обладают меньшим временем циркуляции в крови. Гликозилированные белки могут быть синтезированы также в культуре клеток высших эукариот, однако с несравнимо большими технологическими и финансовыми затратами. Препараты Иммукин, Актимьюн, Ингарон не являются полностью идентичными человеческому интерферону (негликозилированы). Отсутствие гликоцепей в бактериальном гамма-интерфероне приводит к меньшей эффективности образования биологически активного димера. В результате удельная активность бактериального гамма интерферона меньше активности гликозилированного, полученного в бакуловирусной системе экспрессии или из молока трансгенных мышей в 2 раза. Наиболее распространённым способом получения гликозилированных белков является экспрессия в культуре клеток китайского хомячка (CHO). Однако в случае гамма интерферона человека при экспрессии в культуре клеток CHO удельная антивирусная активность падает в 4 раза по сравнению с бактериальным белком, возможно, из-за интенсивного процессинга С-конца (J Interferon Res. 1986 Dec;6(6):687-95). К настоящему времени не удалось найти в литературе упоминаний о сравнении фармокинетики и иммунногенности гликозилированного и бактериального гамма инетрферонов, однако на основании имеющихся многочисленных подобных данных для других белков гликозилированнный препарат, как правило, бывает предпочтительнее. Это особенно важно, учитывая высокую частоту побочных реакций, описанных для препаратов Иммукин, Актимьюн, Ингарон. Таким образом, для получения качественного и недорогого препарата гамма интерферона человека наиболее подходящим подходом является экспрессия гамма интерферона в молоке трансгенных животных.

Целью научных исследований группы трансгеноза ИБХ РАН под руководством к.б.н. Иванова И.И. является получение исходных компонентов коммерческих лекарственных препаратов интерферонов гамма из молока трансгенных животных для лечения опасных заболеваний человека. Группа оснащена всем необходимым оборудованием для проведения перечисленных научных исследований (ламинары, микроскопы, микроинъекторы, микроманипуляторы, виварий). С учетом уникальности препарата на основе трансгенных животных, обоснованным является предположение о завоевании эффективной монополии на рынке препаратом ИФН-гамма группы трансгеноза ИБХ РАН. При этом предполагается создать на основе группы трансгеноза малое инновационное предприятие под руководством к.б.н. Иванова И.И.

Основные задачи: 1) получение трансгенных кроликов с высоким уровнем экспрессии в молоке гена человеческого ИФН-гамма, выращивание из их потомства стада, разработка выделения и очистки лекарственного препарата из молока трансгенных кроликов. Препарат, полученный таким методом, будет практически идентичен природному интерферону человека (гликозилирован) и безопасен для потребителя. 2) выход на рынок с гликозилированным ИФН-гамма Группой трансгеноза ИБХ РАН достигнуты следующие результаты: — созданы и охарактеризованы гибридные гены, обеспечивающие высокий уровень экспрессии ИФН-гамма в молоке трансгенных млекопитающих, что подтверждено патентом РФ № 2084526 от 1994 года и публикацией в журнале Nature biotechnology (срок патента заканчивается в 2014 г.); — впервые получены трансгенные млекопитающие (мыши), содержащие ИФН-гамма в молоке в концентрации 0,5 г/л, — доказано, что интерферон гамма из молока млекопитающих животных функционально активен и гликозилирован, подобно человеческому (статья в журнале «Nature biotechnology» в 1995 году). Аналогичные препараты, получаемые из бактерий, негликозилированы и поэтому иммуногены; — подтверждено, что уровень экспрессии ИФН-гамма в молоке трансгенных мышей передаётся по наследству, что делает возможным промышленное производство. Поскольку созданная группой трансгеноза ИБХ РАН генно-инженерная конструкция гибридного гена является универсальной для всех млекопитающих, получение трансгенных кроликов с высоким уровнем экспрессии ИФН-гамма в молоке представляется чисто технической задачей. Кролики занимают промежуточное положение среди других животных, используемых в качестве биореакторов. С одной стороны, одна крольчиха в период лактации способна дать до 50 мл молока в день, с другой стороны, частота трансгенных животных среди потомства, низкая стоимость разведения и быстрый цикл воспроизводства у кроликов приближаются к аналогичным показателям у мышей. Себестоимость препарата предполагается невысокой, т. к. стадо трансгенных крольчих в 300 голов обеспечит на сегодняшний день потребности России в этом препарате. Если потребность в препарате будет расти, поголовье стада можно будет легко увеличить.

Сроки разработки препарата: 1. Создание трансгенных кроликов – 12 месяцев 2. Размножение кроликов и получение опытных партий молока – 6-8 месяцев 3. Разработка технологии выделения и очистки пробной партии препарата – 4 месяца

Ожидаемые технико-экономические параметры препарата (расчетные). Удельный выход препарата (от одной крольчихи): — за 1 период лактации (7 дней) – 0.35 л молока (ежедневно 1 дойка по 50 мл); — за 6 периодов лактации в год – 2.1 л молока; При ожидаемой концентрации ИФН-гамма в молоке 0,5 г/л от одной крольчихи в год можно получить 1.05 г неочищенного белка. При выделении и очистке потери составят не более 50%. Итого: 0.5 г очищенного препарата от 1 крольчихи в год. Одна доза американского бактериального препарата Актимьюн содержит 50 мкг ИФН-гамма, следовательно, 0.5 г нашего препарата будет содержать 10 000 доз. По имеющимся у нас данным, удельная активность нашего препарата будет выше в несколько раз, т.о. одна крольчиха за год потенциально способна произвести ИФН-гамма в количестве от 20 000 до 30 000 доз. Есть все основания полагать, что разрабатываемый препарат составит серьезную конкуренцию имеющимся на мировом рынке препаратам ИФН-гамма как по качеству, так и по цене. В случае существующих препаратов возможными действиями производителей могут быть: усиление эффективности препарата и удешевление его производства. Однако анализ особенностей получения препарата из молока трансгенных животных позволяет предполагать, что для существующих препаратов невозможно добиться таких показателей. С учетом уникальности созданного исследовательско-технологического цикла производства лекарственных препаратов на основе трансгенных животных, обоснованным является предположение о высокой конкурентоспособности препарата ИФН-гамма группы трансгеноза ИБХ РАН по сравнению с имеюшимися на рынке препаратами.

Группа обладает оборудованием (закуплено в 85 - 90гг.), которое планируется передать создающемуся МИП в лизинг на 10 лет по следующим ценам: – автоматические пипетки Gilson (10 шт) - 1400 € – настольный ламинарный бокс Gelaire (Flow labolatories, Италия) - 9600 € – водяной термостат Eppendorf 2763 (Германия) - 1100 € – встряхиватель Eppendorf 5432 (Германия) - 150 € – настольная центрифуга Eppendorf 5413 (Германия) - 2200 € – настольная центрифуга с охлаждением Jouan MR 14.11 (Франция) - 5500 € – система вакуумного испарения SpeedVac (Savant Instruments, inc., США) - 4700 € – транслюмминатор Black-Ray (Ultra-violet prod. Inc, США) - 1100 € – термостат Centromat H (B. Braun Melsungen AG, Германия) - 1200 € – аналитические весы Sartorius - 3600 € – автоклав вертикальный PBI Autoclave Stematic 3 (Италия) - 5500 € – система получения деионизованной воды Milli-Q (Millipore, США) - 5800 € – микродиспенсер Microlab P (Hamilton, Швейцария) - 2100 € – стереомикроскоп Techival 2 (Carl Zeiss Jena, Германия) - 2500 € – инвертированный микроскоп с DIC оптикой ICM405 (Opton, Германия) - 8600 € – электрические манипуляторы (Opton, Германия) - 35000 € – микроинъектор Eppendorf 5242 (Германия) - 12000 € – вытягиватель каппиляров PE-2 (Narishige, Япония) - 3200 € – микрокузница MF-9 (Narishige, Япония) - 3600 € – источник тока EPS 500/400 (Pharmacia, Швеция) - 600 € – приборы для электрофореза GNA100, GNA200 (Pharmacia, Швеция) - 800 € – лазерный оптический денситометр 2202 Ultrascan (LKB, Швеция) - 2700 € – амплификатор ДНК OmniGene (Hybaid, Великобритания) - 8100 €

С учетом наличия данного оборудования для получения эффективного коммерческого препарата сформирован необходимый состав единовременных и текущих (годовых) издержек, приведенный в таблице.
|Издержки |Сумма, руб. |
|Годовые отчисления ИБХ (10% от суммы инвестиций) |520 515,00 |
|Годовая аренда рабочих помещений |144 417,80 |
|Стоимость кролика |400-500 |
|Доставка одной партии животных(20 кроликов - 1 партия) |22500,00 |
|Содержание кроликов в год |120000,00 |
|Годовой фонд ЗП персоналу вивария | |
| Заведующий виварием |224460,00 |
| 3 сотрудника вивария |897840,00 |
| Ветеринар |448920,00 |
|Аренда вивария в год |180000,00 |
|Годовой фонд ЗП: | |
| Руководитель группы |1197120,00 |
| Бухгалтер |448920,00 |
| 4 научных сотрудника, производящих микроинъекции и операции на кроликах |1496400,00 |
| Научный сотрудник, проводящий анализ новорожденных кроликов на трансгенность (отбор тканей, ПЦР-анализ)|448920,00 |
| Сотрудник, получающий очищенный препарат из молока кроликов |304764,00 |
|Транспортные расходы (в год) |120000,00 |

Покрытие суммы издержек планируется за счет инвестиций.

Препарат будет выпускаться в лиофилизированной форме, предназанченной для инъекций (500000МЕ), причем имеется возможность покрыть всю потребность рынка в данном препарате – увеличить объемы производства не составит труда, это займет, по предварительным оценкам, 4-5 месяцев и не потребует никаких дополнительных затрат. 1. Создание трансгенных кроликов – 12 месяцев Для производства препарата нужно создание трансгенных кроликов. Эта технология нуждается в некоторой доработке, сроки доработки — 8 месяцев. При наличии технологии для создания трансгенных кроликов нужны, соответственно, только сами кролики – одного возраста и чистые от всяких болезней и инфекций. Такой кролик стоит 450 рублей. Планируется получить 2-3 независимые линии трансгенных кроликов-фаундеров, из потомства которых можно будет получить стадо трансгенных животных. Для получения одной линии необходимо: – аренда вивария на 4 месяца с пропускной способностью 100 кроликов в месяц (клетки, маточные клетки, корм, ветеринар, 2 сотрудника по уходу). – проведение операций на кроликах в режиме: 3 месяца по 4 операционных дня в неделю. В один операционный день будет прооперировано 5 кроликов (2 донора, 3 реципиента). Понадобится участие 4 сотрудников (2 на микроинъекциях, 2 - оперирующих), а также: – медикаменты (анестезия, антибиотики и пр.) – аренда операционной в виварии Для одной линии в виварии необходимо: 1. 40 мест для предоперационных животных: доноров, которые после операции не используются повторно, и в их клетки поступают новые, и реципиентов, которые после операции становятся беременными самками и переходят во второе отделение. 2. 40 мест для послеоперационных беременных самок, вынашивающих потомство в течение месяца. 3. 20 мест для новорожденных кроликов. В двухнедельном возрасте крольчата проверяются на трансгенность, все нетрансгенные выбраковываются и дальше не используются. Повтор приведённых выше пунктов для получения 2-й и 3-й линий

2. Размножение кроликов и получение опытных партий молока – 6-8 месяцев Работу можно вести параллельно с операциями по получению 2-й и 3-й линии трансгенных кроликов. Выращивание обнаруженных трансгенов, скрещивание, отбор молока у беременных трансгенных самок.

3. Выделение и очистка пробной партии препарата – 4 месяца Выделение в лабораторных условиях белка из молока от двух-трех самок за весь период лактации (по 0,35 л от каждой) производится в соответствии с ранее разработанной методикой. После каждой стадии производится определение удельной активности ИФН-гамма.

Методология получения первого трансгенного кролика является коммерческой тайной. Она представляет собой ноу-хау и может являться предметом беспатентной лицензии в случае инвестиционного сотрудничества либо продажи технологии. Ожидаемый препарат является основой для подачи патентной заявки. После прохождения полученным препаратом клинических исследований планируется его сертификация (получение Государственной лицензии). В перспективе ожидается аттестация препарата на соответствие Правилам организации производства и контроля качества лекарственных средств (GMP).

Для создаваемого малого инновационного предприятия (МИП) необходимо: 1) определить ключевые факторы успеха (КФУ); 2) разработать организационный план; 3) маркетинг: стратегию, каналы распространения, ценообразование, продвижение; 4) определить риски, присущие данному виду деятельности; 5) определить стратегию финансирования.

----------------------- [1] Трансгенные животные – это индивидуумы, в геном которых искусственно введена дополнительная генетическая информация (трансген). Такая информация представляет собой либо отдельный участок ДНК с собственными (гомологичными) регуляторными последовательностями (эукариотическая транскрипционная единица), либо сконструированный из различных молекул ДНК гибридный (рекомбинантный) ген. Таким образом, трансген – это искусственно введенный и интегрировавшийся в ДНК животных чужеродный ген.