GENETIK
Der Aufbau der DNA
- Struktur der DNA1953 von Watson und Crick entschlüsselt
- DNA besteht aus zwei gegenläufigen Einzelsträngen, wobei jeder Einzelstrang ein 5‘- und ein 3‘-Ende besitzt
- Doppelhelixstruktur: Strickleiterstruktur, die um eine Achse miteinander verwunden sind
- Holme der „Strickleiter“ werden aus sich abwechselnden Zucker- und Phosphatresten gebildet, die über feste Atombindungen miteinander verknüpft sind
- Sprossen der „Strickleiter“ bestehen aus je zwei organischen Basen (Basenpaar), die über Wasserstoffbrückenbindungen (WBB) miteinander verbunden sind
- insgesamt besteht die DNA aus vier verschiedenen organischen Basen:
Purine: Adenin (A) und Guanin (G)
Pyrimidine: Thymin (T) und Cytosin (C) -> in der RNA ist Thymin durch Uracil (U) ersetzt
- Basenpaare werden von jeweils zwei komplementären Basen gebildet: A und T und C und G
- zwischen A und T bilden sich zwei WBB, C und G sind über drei WBB miteinander verknüpft
- jeweils drei solcher Basenpaare, wie sich in einem DNA-Einzelstrang direkt hintereinander liegen, bilden ein Basentriplett oder Codon
- Jedes Basentriplett codiert für eine von 20 Aminosäuren, aus denen die Proteine aufgebaut sind
- Reihenfolge der Basen bestimmt also die Reihenfolge der Aminosäuren in den Proteinen
- der genetische Triplett-Code ist „kommafrei“ (Basensequenz wird durchgehend abgelesen), nicht überlappend (eine Base gehört nie zwei Tripletts an), redundant (viele Aminosäuren werden von mehr als einem Triplett codiert, zB. Phenylalanin durch AAA und AAG), universell, kolinear (Reihenfolge der Codewörter der DNA ist gleich mit der Abfolge der Aminosäuren im Protein) und eindeutig (immer eine bestimmte Nukleotidsequenz legt eine entsprechende Aminosäure-Sequenz fest)
- Information der DNA wird bei der Proteinbiosynthese in Aminosäuren bzw. Proteinen umgewandelt

Replikation – die Verdopplung der DNA
- mit Hilfe von Enzymen kann sich DNA selbst verdoppeln
- sie wird nach dem semi-konservativen Prinzip repliziert
- Doppelhelix wird zunächst durch das Enzym Helicase entwunden und deren WBB getrennt
- ein Einzelstrang dient als Matrize für den neu zu synthetisierenden, komplementären Gegenstrang (d.h. replizierte DNA besteht jeweils aus einem alten und einem neu synthetisierten Einzelstrang -> semi-konservativ)
- an der entstandenen Replikationsgabel lagern sich Proteine an und verhindern, dass sich die Einzelstränge wieder miteinander verbinden
- am 3‘-Ende lagern sich freie Nukleotide an die komplementären Basen an und bilden neue WBB
- am 5‘-Ende muss ein RNA-Primer den Startpunkt der Neusynthese markieren, damit die DNA-Polymerase einen Ansatzpunkt hat um freie Nukleotide an den Einzelstrang zu binden
- da die Verknüpfung jedoch nur in 3‘->5‘-Richtung verlaufen kann, benötigt die Synthese immer wieder neue RNA-Primer
- es entstehen Einzelstücke (Okazaki-Fragmente), die durch das Enzym Ligase zu einem vollständigen Strang miteinander verbunden werden
- Ligase entfernt auch die Primer
- aus einem DNA-Molekül sind somit zwei entstanden!

Proteinbiosynthese

- Entsprechend der Basensequenz bildet die Zelle im Zuge der Proteinbiosynthese (PBS) Aminosäureketten, aus denen dann Proteine entstehen
- PBS läuft in zwei Schritten ab:
1. Die Transkription
- da sich die DNA im Zellkern befindet und die Ribosomen (Orte der PBS) im Cytoplasma diffundieren, muss die DNA zunächst aus dem Zellkern an die Ribosomen gelangen
- zu Beginn muss der DNA-Doppelstrang durch Helicase entwunden und gespalten werden
- an den Einzelstrang lagern sich freie RNA-Nukleotide an und verbinden sich zu einem mRNA-Strang
- mRNA-Strang löst sich nach der Fertigstellung vom Matrizenstrang und verlässt den Zellkern durch die Kernporen
2. Die Translation
- mRNA wandert an ein Ribosom und bindet dort zunächst an die kleine Untereinheit
- um auch die große Untereinheit funktionsfähig zu machen, muss zunächst die tRNA Aminosäuren entsprechend der Codonfolge zur mRNA bringen
- Anticodon am Ende der tRNA kann mit Hilfe von Synthease an das Codon der mRNA binden -> mit dem Startcodon AUG und somit der Start-tRNA UAC kann die Translation beginnen und die große Unterheit kommt hinzu (funktionsfähiges Ribosom)
- zweites tRNA-Molekül findet die zweite Bindungsstelle im Ribosom -> Aminosäuren (AS) werden über Peptidbindungen miteinander verknüft
- Ribosom rückt drei Stellen weiter, sodass die nächste tRNA binden kann -> es entsteht eine Polypeptidkette mit festgelegter AS-Sequenz
- Translation wird an den Stoppcodons der mRNA beendet -> AS lösen sich ab und tRNA verlässt das Ribosom
- Ribosom zerfällt in seine Untereinheiten und aus den AS können Proteine entstehen

Mutationen
- man unterscheidet 4 Formen von Mutationen:
1. Genmutationen: verändert die Basensequenz einzelner Gene -> kann durch Ersatz, Einfügen oder Verlust eines oder mehrerer Nukleotidpaare zustande kommen
Punktmutationen:
- Ersatz eines Nukleotids und seines komplementären Partners im DNA-Strang durch ein anderes Nukleotidpaar
- Stumme Mutationen: haben aufgrund der redundanz des genetischen Codes keine Auswirkungen -> selbe Aminosäure wird übersetzt
- Missense Mutationen: führen weiterhin zum Codieren einer Base, jedoch für die falsche -> ist die Aminosäure der vorherigen ähnlich, hat es kaum Auswirkungen für den Organismus
- Nonsense Mutationen: können funktionsunfähige Proteine codieren -> Einbau eines Stoppcodons, welches die Translation abbricht
Rasterschubmutationen:
- entweder eine zusätzliche Base eingebaut oder entnommen
- Leseraster der Ribosomen verschiebt sich -> es werden völlig falsche Aminosäuren codiert
2. Genommutationen: Veränderungen im Chromosomensatz eines Organismus
- numerische Chromosomenaberrationen entstehen meist bereits bei der Zellteilung
- Aneuploidie: einzelne Chromosomen fehlen oder sind überzählig (z.B. Trisomie 21: Chromosom 21 ist 3-fach vorhanden, statt 2-fach)
- Polyploidie (meist bei Pflanzen): gesamter Chromosomensatz ist verdoppelt -> es entstehen Artbastarde (keine Fortpflanzung möglich)

3. Chromosomenmutationen: Veränderungen an oder in einzelnen Chromosomen eines Organismus
- Deletion: Stücke eines Chromosoms fehlen, sind „gelöscht“
- Duplikation: Stücke eines Chromosoms sind verdoppelt
- Inversion: Stücke sind durch schleifenbildung verkehrt herum im Chromosom eingebaut
- reziproke Translokation: Stücke eines Chromosoms sind auf ein anderes übertragen
- Fusion: aus zwei kleinen, wird ein großes Chromosom
- Fission: aus einem großen, werden zwei kleine Chromosomen

Mutagene
- normalerweise treten Mutationen spontan und ohne äußere Einwirkung auf
- Mutagene sind synthetische Substanzen (chemische Mutagene), sowie Strahlen (physikalische Mutagene), die Mutationen hervorrufen können -> spielen große Rolle bei der Krebsentstehung
- als physikalische Mutagene wirken besonders ionisierende Strahlen (radioaktive Strahlung und Röntgenstrahlung) und Ultraviolettstrahlen
- chemische Mutagene (Nitrite, Aflatoxine, Benzpyren, Methylierungsmittel, usw.) verändern meisten die Nukleotide der DNA
- Mutagene erhöhen die Mutationsrate (normale Mutationsrate liegt bei 10-5 – 10-9 pro Gen und Generation)

Regulation der Genaktivität
- 1961 von Jacob und Monod entwickelt
- energieschonender Stoffwechsel -> Gene werden nur bei Bedarf bestimmter Enzyme aktiviert
Substratinduktion am Beispiel des Lac-Operons
- durch das Regulatorgen wird ein aktiver Repressor hergestellt -> dieser bindet an den Operator und verhindert die Transkription der Gene des Lactosestoffwechsels
- gibt man jedoch Lactose hinzu, so lagern sich die Lactosemoleküle an den Repressor an
- die Raumstruktur des Repressors verändert sich und der Repressor wird inaktiv
- RNA-Polymerase kann die Transkription fortsetzen

Endproduktrepression am Beispiel des Tryp-Operons
- in einigen Fällen bewirkt die steigende Konzentration des Endprodukts, dass eine Synthese abgebrochen wird -> Feedback-Hemmung
- Informationen für die Tryptophan bildenden Enzyme sind in den Struktur-Genen enthalten
- zunächst ist der Repressor inaktiv und die Synthese von Tryptophan aufbauenden Enzymen kann stattfinden
- steigt nun die Tryptophan-Konzentration, so binden Tryptophan-Moleküle an den Repressor und aktivieren diesen
- Die Synthese wird abgebrochen

Stammbaumanalyse und Erbgänge Gonosomale Erbgänge:
- gonosomale Erbkrankheiten, also solche, bei denen die Veränderung die Geschlechtschromosomen X bzw. Y betrifft, liegen in den meisten Fällen auf dem X-Chromosom, da das Y-Chromosom nur sehr wenige Gene enthält
Am Beispiel der X-chromosomalen Vererbung werden folgende Besonderheiten deutlich:
- x-chromosomal-dominant: - x-chromosomal-rezessiv: Autosomale Erbgänge:
- Besonderheiten treten nur dann in Erscheinung, wenn sich auf jeweils beiden Chromosomen (nicht den Geschlechtschromosomen X und Y) eine Veränderung findet, d.h. wenn der betroffene Patient jeweils eine Veränderung von seinem Vater und eine von seiner Mutter geerbt hat
- autosomal-dominant: - autosomal-rezessiv: Gentechnik
Polymerase-Kettenreaktion:
- PCR ist ein enzymabhängiges Verfahren zur Vervielfältigung bestimmter Gen-Sequenzen innerhalb einer vorliegenden DNA
- ermöglicht schnelles Vervielfältigen eines DNA-Abschnittes, um diesen genauer untersuchen zu können
1. Denaturierung bei etwa 95°C: Die WBB zwischen den Doppelsträngen werden gelöst, sodass zwei Einzelstränge entstehen
2. Hybridisierung bei etwa 60°C: die DNA-Primer können jetzt an die Einzelstränge binden
3. DNA-Polymerisierung bei etwa 70°C: am 3‘-Ende des Primers kann die Taq-Polymerase mit der Synthese des neuen Komplementärstranges beginnen
- Nach Beendigung der Polymerisation beginnt der Zyklus von vorne, die Temperatur wird wieder erhöht, die Doppelstränge denaturieren; es erfolgt die Abkühlung, die Primer hybridisieren; die Polymerisation schließt sich an.
- PCR kann im Thermocycler solange fortlaufen, bis die in der Lösung vorhandenen Taq-Polymerasen nicht mehr ausreichen, um alle Primer zu belegen

Genetischer Fingerabdruck:
1. DNA-Isolierung: beispielsweise aus Zellen der Mundschleimhaut, aus einem Blutfleck, aus Speichelrückständen auf Zigaretten oder aus Spermaresten kann DNA extrahiert werden
2. DNA-Vervielfältigung: spezifische Bereiche der DNA werden mithilfe der PCR vervielfältigt
3. Bildung von DNA-Restriktionsfragmenten: zu ver vervielfältigten DNA werden bestimmte Restriktionsenzyme gegeben, die die DNA in unterschiedlich lange Stücke zerlegt, wodurch Restriktionsfragmente entstehen
4. Gelelektrophorese: die Restriktionsfragmente werden mittels der Gelelektrophorese aufgetrennt, wodurch die Fragmente sich ihrer Länge entsprechend anordnen.
- hierbei macht man sich die Eigenschaft elektrisch geladener Körper zu nutze, die in einem elektrischen Feld eine unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit aufweisen
- Trennung wird durch die im Geld vorhandenen Poren erreicht, die wie ein Sieb wirken und deren Größe die Wanderungsgeschwindigkeit der DNA bestimmen
- DNA ist negativ geladen und wandert stets zur Anode (+-Pol)
- Wanderungsgeschwindigkeit von der Länge und Konformität der Fragmente abhängig: kurze DNA-Fragmente wandern schneller als lange
- die kürzesten Stränge wandern im Gel am weitesten in Richtung Anode

Methoden der Bakteriengenetik Stempeltechnik:
- dient dazu, die Mangelmutanten eines Bakterienstammes zu identifizieren und zu isolieren
- man erhöht die Mutationsrate in einem Bakterienstamm (zB. Durch UV-Strahlung)
- es entstehen Mangelmutanten, die eine oder mehrere der 20, zur Teilung notwendigen, Aminosäuren nicht mehr selbst herstellen können
- man streicht den Bakterienstamm auf einen Minimalnährboden (enthält keine AS) -> normale Bakterien können sich teiolen, Mangelmutanten jedoch nicht
- man gibt nun ein Antibiotikum (z.B. Penicillin) hinzu, das alle sich teilenden Bakterien abtötet -> nur die Mangelmutanten überleben
- nun streicht man alle Bakterien auf einen Vollnährboden (enthält alle 20 AS -> Bakterien können sich teilen)
- nun drückt man einen Stempel aus sterilem Samt auf den Stamm und danach auf einen anderen Nährboden, dem eine bestimmte AS fehlt -> Muster, bzw Anordnung auf dem Nährboden bleibt erkennbar
- alle Bakterien, die diese AS herstellen können, werden sich teilen
- ist eine „Lücke“ auf dem Nährboden, so erkennt man die Stelle, an der sich die Bakterien befinden
- letztendlich kann man die Mangelmutanten von den anderen Bakterien isolieren

Verdünnungsreihen:
- dienen dazu, einen Bakterienstamm zu verkleinern und ihn zählbar zu machen
¬- mehrere Reagenzgläser werden mit 9ml steriler, 0,9%iger NaCl-Lösung gefüllt
- man gibt 1ml der Suspension der Bakterien in das erste Reagenzglas
- Reagenzglas wird gut gemischt
- aus dem 1. Reagenzglas wird 1ml in das 2. Reagenzglas gegeben, usw.
- so erhält man bei jedem Schritt eine Verdünnung von 10-1